一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒，该试剂盒包括：无细胞蛋白表达冻干粉和谷氨酸镁，无细胞蛋白表达冻干粉用下述方法制成：(1)称取谷氨酸镁和组合物1，混合；(2)向步骤(1)获得的混合物中，加入组合物2，混合均匀；(3)冷冻干燥，得到无细胞蛋白表达冻干粉。本发明专利技术的试剂盒能具有较高的蛋白表达活性，是实现无细胞蛋白合成体系的常温存储和应用的前提和保障。本发明专利技术的高活性无细胞蛋白表达试剂盒，储存及运输方便。

A Kit for High Active Acellular Protein Expression

The invention discloses a high-activity acellular protein expression kit, which comprises: acellular protein expression freeze-dried powder and magnesium glutamate, and acellular protein expression freeze-dried powder made by the following methods: (1) weighing magnesium glutamate and compound 1, mixing; (2) adding compound 2 to the mixture obtained by step (1) mixing evenly; (3) freeze-drying to obtain acellular protein. Express lyophilized powder. The kit of the invention has high protein expression activity, and is the precondition and guarantee for the storage and application of the acellular protein synthesis system at room temperature. The high activity acellular protein expression kit of the invention is convenient for storage and transportation.

【技术实现步骤摘要】
一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒
本专利技术涉及一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒。属于生物合成领域。
技术介绍
传统的蛋白表达是指通过细菌、酵母、植物细胞或动物细胞等表达外源基因的生物学技术。随着科学技术的发展，与蛋白质相关的前沿领域逐渐兴起，无细胞蛋白合成系统应运而生，其是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞提取物中补加各种底物和能源物质来合成蛋白质的体外系统(SmithMT,BennettAM,HuntJM,etal.Creatingacompletely“cell－free”systemforproteinsynthesis[J].BiotechnolProg,2015,10:2157.)。无细胞蛋白表达系统具有诸多优势，例如表达周期短、反应条件易控制、蛋白产量高、可表达细胞不能表达的蛋白质，甚至是对细胞有毒害作用的特殊蛋白质，这使得它在高通量表达目的蛋白和合成生物学方面得到了广泛的应用(HodgmanCE,JewettMC.Cell-freesyntheticbiology:Thinkingoutsidethecell[J].MetabolicEngineering,2012,14(3):261-269)。然而，由于无细胞蛋白系统中存在大量合成蛋白所需要的酶系，需储存在-20℃或-80℃的低温或超低温条件下(SmithMT,BerkheimerSD,WernerCJ,etal.LyophilizedEscherichiacoli-basedcell-freesystemsforrobust,high-density,long-termstorage.[J].Biotechniques,2014,56(4):186.，其储存和运输均受到极大的限制。因此开发一种可常温储存并方便携带的高活性无细胞蛋白表达试剂盒是扩大无细胞蛋白表达系统应用前提和保证。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒。本专利技术的第二个目的是提供一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒的使用方法。本专利技术的技术方案概述如下：一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒，包括：无细胞蛋白表达冻干粉和谷氨酸镁，无细胞蛋白表达冻干粉用下述方法制成：(1)按质量比为(0.4-5):1000的比例，称取谷氨酸镁和组合物1，混合；所述的组合物1按1g:0.01～0.1ml:1～3ml比例包括细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；(2)向步骤(1)获得的混合物中，加入组合物2，混合均匀；所述组合物1和组合物2的体积比为1:(1-3)；所述的组合物2按体积比为(2-8):(20-30):(2-5):1的比例包括氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液：(3)冷冻干燥，得到无细胞蛋白表达冻干粉。步骤(1)所述细胞为真核细胞或原核细胞。优选地，缓冲溶液1包括：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇，5-10mmol/L2-巯基乙醇，溶剂是去离子水。优选地，缓冲溶液2包括：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水。优选地，氨基酸混合液为用甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸加入水配成的等摩尔浓度的、摩尔浓度为5-20mmol/L的混合液。优选地，反应缓冲液包括：40-60mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸钾、10-40mmol/L3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L环磷酸腺苷、2-4mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1-4mmol/L辅酶A、0.4-0.8mmol/L亚叶酸、1-5mg/mL转运核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水。优选地，能量补充液包括：1-3mmol/L三磷酸尿苷，1-3mmol/L三磷酸胞苷，1-3mmol/L三磷酸腺苷，3-9mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。步骤(3)冷冻干燥的步骤优选为：将步骤(2)获得的混合物在液氮中冷冻，再于-80℃冷冻6-12h，-50℃～-30℃干燥4-48h。上述一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)取无细胞蛋白表达冻干粉0.1-2mg，用30-80μl的去离子水溶解；(2)按质量，将(0.5-2.0)份的谷氨酸镁加入到1000份步骤(1)获得的液体中；(3)向步骤(2)得到的体系中加入基因，在25℃～30℃，表达，得到蛋白质。基因为能表达所需蛋白质的基因组、质粒、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸中的至少一种。本专利技术的优点如下：本专利技术的试剂盒能具有较高的蛋白表达活性，是实现无细胞蛋白合成体系的常温存储和应用的前提和保障。本专利技术的高活性无细胞蛋白表达试剂盒，储存及运输方便。附图说明图1用无细胞蛋白表达系统eGFP在表达12h之后的产量。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本专利技术，但并不对本专利技术作任何限制。实施例1-3为缓冲溶液1的配方，见表1。表1实施例1实施例2实施例3三羟甲基氨基甲烷20mmol/L10mmol/L5mmol/L谷氨酸钾100mmol/L60mmol/L30mmol/L谷氨酸镁20mmol/L15mmol/L10mmol/L二硫苏糖醇2mmol/L1mmol/L0.5mmol/L2-巯基乙醇10mmol/L8mmol/L5mmol/L溶剂是去离子水补足至1L补足至1L补足至1L实施例4-6为缓冲溶液2的配方，见表2。表2实施例4实施例5实施例6三羟甲基氨基甲烷20mmol/L10mmol/L5mmol/L谷氨酸钾100mmol/L60mmol/L30mmol/L谷氨酸镁20mmol/L15mmol/L10mmol/L二硫苏糖醇2mmol/L1mmol/L0.5mmol/L溶剂是去离子水补足至1L补足至1L补足至1L实施例7细胞破碎产物的制备：将培养后的大肠杆菌(大肠埃希氏菌BL21(DE3)CICC23796，购买于CICC)收集、悬浮、离心、用机械法破碎、保存。细胞破碎的方法除机械法外，还可以采用反复冻融法、超声处理法、酶解法、碱裂解法或化学渗透法。破碎过程采用超声波细胞粉碎机，功率为20W，每个循环超声5s，停10s，总时间为1h(每次取15mL进行破碎)。实施例8-10为组合物1的配方，见表3.表3实施例8实施例9实施例10细胞破碎产物实施例7制备1g实施例7制备1g实施例7制备1g缓冲溶液1实施例1制备0.1ml实施例2制备0.05ml实施例3制备0.01ml缓冲溶液2实施例4制备3ml实施例5制备2ml实施例6制备1ml实施例11-13为氨基酸混合液的配方，见表4表4实施例11实施例12实施例13甘氨酸20mmol/L10mmol/L5mmol/L丙氨酸20mmol/L10mmol/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒，其特征是包括：无细胞蛋白表达冻干粉和谷氨酸镁，所述无细胞蛋白表达冻干粉用下述方法制成：(1)按质量比为(0.4‑5):1000的比例，称取谷氨酸镁和组合物1，混合；所述的组合物1按1g:0.01～0.1ml:1～3ml比例包括细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；(2)向步骤(1)获得的混合物中，加入组合物2，混合均匀；所述组合物1和组合物2的体积比为1:(1‑3)；所述的组合物2按体积比为(2‑8):(20‑30):(2‑5):1的比例包括氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5‑150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液：(3)冷冻干燥，得到无细胞蛋白表达冻干粉。

【技术特征摘要】
1.一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒，其特征是包括：无细胞蛋白表达冻干粉和谷氨酸镁，所述无细胞蛋白表达冻干粉用下述方法制成：(1)按质量比为(0.4-5):1000的比例，称取谷氨酸镁和组合物1，混合；所述的组合物1按1g:0.01～0.1ml:1～3ml比例包括细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；(2)向步骤(1)获得的混合物中，加入组合物2，混合均匀；所述组合物1和组合物2的体积比为1:(1-3)；所述的组合物2按体积比为(2-8):(20-30):(2-5):1的比例包括氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液：(3)冷冻干燥，得到无细胞蛋白表达冻干粉。2.根据权利要求1所述的一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒，其特征是步骤(1)所述细胞为真核细胞或原核细胞。3.根据权利要求1所述的一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒，其特征是缓冲溶液1包括：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇，5-10mmol/L2-巯基乙醇，溶剂是去离子水。4.根据权利要求1所述的一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒，其特征是缓冲溶液2包括：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水。5.根据权利要求1所述的一种高活性无细胞蛋白表达试剂盒，其特征是氨基酸混合液为用甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、...

【专利技术属性】
技术研发人员：仰大勇，郭小翠，朱艺，白丽慧，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12