一种小鼠单个核细胞分离方法技术

本发明专利技术公开了一种小鼠单个核细胞分离方法，包括以下操作步骤：采用断颈法处死小鼠，找到脾脏组织转移入细胞培养间；使用pbs缓冲液进行清洗脾脏组织，向细胞培养皿内加入适量RPMI培养基，将脾脏放入细胞滤网中央；用活塞轻压研磨脾脏使脾脏细胞分离下来，用移液器将细胞悬液转移至新的离心管内，将细胞悬液200xg离心5min，吸去上清液；然后加入6ml红细胞裂解液重悬细胞，放于冰上孵育10min；孵育结束后加入20mlPBS缓冲液重悬，200xg离心55min后吸去上清液，使用用适量的加入10％FBS的RPMI培养基重悬，使用RPMI培养基采用1：100比例进行稀释，再取稀释后悬液10ul滴加到血球计数板上计数。本发明专利技术操作简单，省时省力，且不需要特殊装置，所提取的细胞悬液中核细胞含量较多，纯度较高。

A Method for Isolation of Mouse Mononuclear Cells

The invention discloses a method for separating mouse mononuclear cells, which comprises the following operating steps: killing mice by neck-cutting method, finding spleen tissue and transferring it to cell culture room; cleaning spleen tissue with PBS buffer solution, adding appropriate RPMI medium to cell culture dish, putting spleen into the center of cell filter; grinding spleen with piston to separate spleen cells; Cell suspension was transferred to a new centrifugal tube with a transpirator. Cell suspension was centrifuged 200 XG for 5 minutes and supernatant was absorbed. Then 6 ml erythrocyte lysate was added to suspend cells and incubated on ice for 10 minutes. After incubation, 20 ml PBS buffer was added to suspend the cell suspension. After centrifugation of 200 XG for 55 minutes, supernatant was absorbed. The supernatant was suspended on RPMI medium with proper amount of 10% FBS. 100% dilution, then take 10 UL drops of suspension after dilution and add them to the blood count board to count. The method has the advantages of simple operation, time saving and labor saving, and no special device is needed. The extracted cell suspension has more nuclear cells and higher purity.

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠单个核细胞分离方法
本专利技术涉及相关细胞分离方法
，具体为一种小鼠单个核细胞分离方法。
技术介绍
细胞分离技术包括离心技术、流式细胞术和细胞电泳。离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。细胞电泳是指在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。目前小鼠单个核细胞的分离主要是通过小鼠外周血进行分离，利用单个核细胞与其他细胞不同的密度进行分离。从小鼠外周血中分离单个核细胞主要的局限和缺点有：一是小鼠外周血取量少，一只成年的小鼠一般而言只能取到1ml外周血用于分离细胞；二是外周血中除了单个核细胞外，还含有大量的红细胞，白细胞等，不易除尽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小鼠单个核细胞分离方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种小鼠单个核细胞分离方法，包括以下操作步骤：S1：获取小鼠脾脏组织：预先准备好通过高压灭菌处理的手术器械，采用断颈法处死小鼠，然后分别剪开小鼠右下腹部的皮肤和粘膜，找到脾脏组织，小心取出放入离心管内，转移入细胞培养间；S2：清洗脾脏：将S1)中所得的脾脏组织放入容器中，使用pbs缓冲液进行清洗，同时准备RPMI培养基；S3：制备细胞悬液：将细胞滤网放在细胞培养皿内，然后向细胞培养皿内加入适量RPMI培养基，将脾脏放入细胞滤网中央；将一次性注射器的活塞抽出，用活塞轻压研磨脾脏使脾脏细胞分离下来，持续轻压研磨直至无明显脾脏组织残留；用移液器将细胞悬液转移至新的离心管内，并用适量RPMI培养基讲细胞滤网上的残留细胞冲洗下来；最后用新的细胞滤网再次过滤细胞悬液并收集；S4：裂解红细胞：将S3)中得到的细胞悬液200xg离心5min，吸去上清液；然后加入6ml红细胞裂解液重悬细胞，放于冰上孵育10min；孵育结束后加入20mlPBS缓冲液重悬，200xg离心55min后吸去上清液，使用用适量的加入10％FBS的RPMI培养基重悬，得到单个核细胞细胞悬液；S5：细胞计数与培养：取10ulS4)中得到的单个核细胞悬液，使用RPMI培养基采用1：100比例进行稀释；再取稀释后悬液10ul滴加到血球计数板上计数。根据计数结果算出所得单个核细胞悬液的细胞密度，将其调整为需要的细胞密度并用含10％FBS的RPMI培养基培养。优选的，所述S3)中两次过滤使用的细胞滤网，采用40um的细胞滤网。优选的，S4)中离心过程采用超高速离心机。优选的，S2)中清洗肝脏组织所用的pbs缓冲液中添加了双抗。优选的，S5)中所得到的单个核细胞，可用于体外培养，也可用于后续的生物学实验。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术操作简单，省时省力，且不需要特殊装置，所提取的细胞悬液中核细胞含量较多，纯度较高，可用于体外培养，也可用于后续的生物学实验。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。具体的：一种小鼠单个核细胞分离方法，包括以下操作步骤：S1：获取小鼠脾脏组织：预先准备好通过高压灭菌处理的手术器械，采用断颈法处死小鼠，然后分别剪开小鼠右下腹部的皮肤和粘膜，找到脾脏组织，小心取出放入离心管内，转移入细胞培养间；S2：清洗脾脏：将S1)中所得的脾脏组织放入容器中，使用pbs缓冲液进行清洗，同时准备RPMI培养基；S3：制备细胞悬液：将细胞滤网放在细胞培养皿内，然后向细胞培养皿内加入适量RPMI培养基，将脾脏放入细胞滤网中央；将一次性注射器的活塞抽出，用活塞轻压研磨脾脏使脾脏细胞分离下来，持续轻压研磨直至无明显脾脏组织残留；用移液器将细胞悬液转移至新的离心管内，并用适量RPMI培养基讲细胞滤网上的残留细胞冲洗下来；最后用新的细胞滤网再次过滤细胞悬液并收集；S4：裂解红细胞：将S3)中得到的细胞悬液200xg离心5min，吸去上清液；然后加入6ml红细胞裂解液重悬细胞，放于冰上孵育10min；孵育结束后加入20mlPBS缓冲液重悬，200xg离心55min后吸去上清液，使用用适量的加入10％FBS的RPMI培养基重悬，得到单个核细胞细胞悬液；S5：细胞计数与培养：取10ulS4)中得到的单个核细胞悬液，使用RPMI培养基采用1：100比例进行稀释；再取稀释后悬液10ul滴加到血球计数板上计数。根据计数结果算出所得单个核细胞悬液的细胞密度，将其调整为需要的细胞密度并用含10％FBS的RPMI培养基培养。进一步的，所述S3)中两次过滤使用的细胞滤网，采用40um的细胞滤网。进一步的，S4)中离心过程采用超高速离心机。进一步的，S2)中清洗肝脏组织所用的pbs缓冲液中添加了双抗。进一步的，S5)中所得到的单个核细胞，可用于体外培养，也可用于后续的生物学实验。实施例：利用本方法制得的单个核细胞悬液，使用LPS刺激单个核细胞增值并用CCK法检测。将利用本方法制得的单个核细胞悬液细胞密度调整为5x106/ml，各取100ul细胞悬液，分为两组；每组3个重复接种于96孔板的一个孔中，共六孔；其中A组只加细胞悬液，B组每孔加细胞悬液外，另加1ug/ml的lps；另设三个对照孔只加培养基；所有孔加样完毕后放入细胞培养箱培养72h。在培养结束前4小时取出96孔板，于每一个孔内加入10ulCCK试剂，放回培养箱继续培养4h，培养结束后利用酶标仪测出每孔在450nm下的吸光度A；其中，单个核细胞增值率＝(AB-A对照)/(AA-A对照)。本专利技术操作简单，省时省力，且不需要特殊装置，所提取的细胞悬液中核细胞含量较多，纯度较高，可用于体外培养，也可用于后续的生物学实验。尽管已经示出和描述了本专利技术的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本专利技术的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本专利技术的范围由所附权利要求及其等同物限定。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠单个核细胞分离方法，其特征在于：包括以下操作步骤：S1：获取小鼠脾脏组织：预先准备好通过高压灭菌处理的手术器械，采用断颈法处死小鼠，然后分别剪开小鼠右下腹部的皮肤和粘膜，找到脾脏组织，小心取出放入离心管内，转移入细胞培养间；S2：清洗脾脏：将S1)中所得的脾脏组织放入容器中，使用pbs缓冲液进行清洗，同时准备RPMI培养基；S3：制备细胞悬液：将细胞滤网放在细胞培养皿内，然后向细胞培养皿内加入适量RPMI培养基，将脾脏放入细胞滤网中央；将一次性注射器的活塞抽出，用活塞轻压研磨脾脏使脾脏细胞分离下来，持续轻压研磨直至无明显脾脏组织残留；用移液器将细胞悬液转移至新的离心管内，并用适量RPMI培养基讲细胞滤网上的残留细胞冲洗下来；最后用新的细胞滤网再次过滤细胞悬液并收集；S4：裂解红细胞：将S3)中得到的细胞悬液200xg离心5min，吸去上清液；然后加入6ml红细胞裂解液重悬细胞，放于冰上孵育10min；孵育结束后加入20mlPBS缓冲液重悬，200xg离心55min后吸去上清液，使用用适量的加入10％FBS的RPMI培养基重悬，得到单个核细胞细胞悬液；S5：细胞计数与培养：取10ulS4)中得到的单个核细胞悬液，使用RPMI培养基采用1：100比例进行稀释；再取稀释后悬液10ul滴加到血球计数板上计数。根据计数结果算出所得单个核细胞悬液的细胞密度，将其调整为需要的细胞密度并用含10％FBS的RPMI培养基培养。...

【技术特征摘要】
1.一种小鼠单个核细胞分离方法，其特征在于：包括以下操作步骤：S1：获取小鼠脾脏组织：预先准备好通过高压灭菌处理的手术器械，采用断颈法处死小鼠，然后分别剪开小鼠右下腹部的皮肤和粘膜，找到脾脏组织，小心取出放入离心管内，转移入细胞培养间；S2：清洗脾脏：将S1)中所得的脾脏组织放入容器中，使用pbs缓冲液进行清洗，同时准备RPMI培养基；S3：制备细胞悬液：将细胞滤网放在细胞培养皿内，然后向细胞培养皿内加入适量RPMI培养基，将脾脏放入细胞滤网中央；将一次性注射器的活塞抽出，用活塞轻压研磨脾脏使脾脏细胞分离下来，持续轻压研磨直至无明显脾脏组织残留；用移液器将细胞悬液转移至新的离心管内，并用适量RPMI培养基讲细胞滤网上的残留细胞冲洗下来；最后用新的细胞滤网再次过滤细胞悬液并收集；S4：裂解红细胞：将S3)中得到的细胞悬液200xg离心5min，吸去上清液；然后加入6ml红细胞裂解液重悬细胞，放于冰上孵育10min；孵育结束后加入20mlPBS缓冲液重悬，200...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁润中，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，中国科学院大学，
类型：发明
国别省市：上海,31