一套快速定性、定量检测六种肠道微生物的引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组，由分别用于检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的六组特异性引物对组成。应用此引物组进行PCR检测结合琼脂糖凝胶电泳可对样品进行定量分析；应用此引物组进行荧光定量PCR检测可对样品进行定量检测。本发明专利技术设计的引物组可在同一PCR反应程序下进行，四小时内实现对肠道中六种常见微生物进行定性、定量检测，在医疗检测和食品卫生等领域应用前景广阔。

A set of primers for rapid qualitative and quantitative detection of six intestinal microorganisms and its application

The invention discloses a set of primer pairs for rapid qualitative and quantitative detection of six common intestinal microorganisms, which are composed of six groups of specific primer pairs for detection of Bacteroides, Lactobacillus, Escherichia coli, Enterococcus, Streptococcus and Bifidobacterium respectively. This primer group was used for PCR detection and agarose gel electrophoresis, which could be used for quantitative analysis of samples. Quantitative detection of samples could be done by fluorescence quantitative PCR detection with this primer group. The primer group designed by the invention can be carried out under the same PCR reaction procedure, and the qualitative and quantitative detection of six common microorganisms in the intestine can be realized within four hours. It has broad application prospects in the fields of medical detection and food hygiene.

【技术实现步骤摘要】
一套快速定性、定量检测六种肠道微生物的引物组及其应用
本专利技术属于微生物
，尤其涉及一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组及其应用。
技术介绍
肠道是人体最为重要的消化器官，也是一个多元化并充满活力的微生物生态系统，寄居着数万亿的微生物。大量研究表明，肠道微生物不仅参与宿主的食物转化，对于机体的神经、免疫等生理功能也具有重要的作用。宏基因组测序发现，在肠道中占优势地位的细菌主要分布于拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和变形菌门中，其中包括拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属等常见的肠道微生物；这些微生物的组成与数量保持动态平衡，同时机体内外的多种因素可能会改变这种平衡，进而影响宿主的生理状态。因此，快速准确地跟踪肠道中常见肠道微生物的组成变化对于监测机体健康具有重要意义。目前对于肠道微生物组成的鉴定主要通过宏基因组测序完成，过程较为复杂，耗时耗力，且花费较多；利用种属特异性引物进行PCR检测和实时荧光定量PCR检测，能够更为快速地实现肠道微生物的定量检测。目前已有的种属特异性检测引物大多以疾病相关的肠道菌作目标菌，针对性强，但普适性较差，且每种引物有单独的检测程序，退火温度与延伸时间不能统一，无法进行同批次实验，过程繁琐。申请人基于拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属以及与其亲缘关系较近的其他菌的16SrRNA基因序列相似性比对，获得了各目标菌区别于其他五种菌以及相近菌的特异性保守序列，并根据该保守序列设计了六组特异性引物对，同时所述的引物组可在同一PCR反应程序下，四小时内实现对肠道中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的微生物进行定性、定量检测，且不涉及价格高昂的试剂和设备。经检索，有关这种能快速定性、定量检测肠道中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的特异性引物组及其应用的专利还未见报道。
技术实现思路
针对现有方法不足，本专利技术要解决的问题是提供一套快速定性、定量检测六种微生物的引物组及其应用。利用该引物组通过PCR反应可以便捷、准确地检测样品中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属六种肠道微生物的存在及数量。本专利技术所述的一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组，由分别用于检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的六组特异性引物对组成；其特征在于：所述用于拟杆菌属检测的引物对是上游引物BacterF5与下游引物BacterR6，该对引物扩增获得135bp拟杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；其中，所述上游引物BacterF5与下游引物BacterR6的核苷酸序列为：上游引物BacterF5：5’-AAGACAACGATGGATAGGGGTT-3’，下游引物BacterR6：5’-TTCACGCTACTTGGCTGGT-3’；所述用于乳杆菌科检测的引物对是上游引物LacterF5与下游引物LacterR6，该对引物扩增获得322bp乳杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；其中，所述上游引物LacterF5与下游引物LacterR6的核苷酸序列为：上游引物LacterF5：5’-ACAATGGACGCAAGTCTGATG-3’，下游引物LacterR6：5’-ACCGCTACACATGGAGTTCCACWGT-3’；所述用于大肠杆菌检测的引物对是上游引物E.coliF3与下游引物E.coliR4，该对引物扩增获得416bp大肠杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；其中，所述上游引物E.coliF3与下游引物E.coliR4的核苷酸序列为：上游引物E.coliF3：5’-GAACGGTAACAGGAAGCAG-3’，下游引物E.coliR4：5’-ATGAACAAAGGTATTAACTTTACT-3’；所述用于肠球菌属检测的引物对是上游引物EnterF3与下游引物EnterR4，该对引物扩增获得180bp肠球菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；其中，所述上游引物EnterF3与下游引物EnterR4的核苷酸序列为：上游引物EnterF3：5’-CTTTCGGGTGTCGCTGAT-3’，下游引物EnterR4：5’-AGACTTTCGTCCATTGCC-3’；所述用于链球菌属检测的引物对是上游引物StrepR4与下游引物StrepR3，该对引物扩增获得267bp链球菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；其中，所述上游引物StrepR4与下游引物StrepR3的核苷酸序列为：上游引物StrepF4：5’-ACAAGATGGACCTGCGTT-3’，下游引物StrepR3：5’-TTACCGTCACTGTGTGAACTT-3’；所述用于双歧杆菌属检测的引物对是上游引物BifiF3与下游引物BifiR4，该对引物扩增获得154bp双歧杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；其中，所述上游引物BifiF3与下游引物BifiR4的核苷酸序列为：上游引物BifiF3：5’-GTCCGGTGTGAAAGTCCATC-3’，下游引物BifiR4：5’-GTAACGGCCCAGAGACCT-3’。本专利技术所述检测六种常见肠道微生物的引物组在利用PCR快速定性检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属中的应用。其中：所述应用方法中涉及的步骤和条件是：(1)配制PCR反应体系，其中每20μL反应体系中含有以下组分：0.2μLrTaqDNAPolymerase、2μL10×PCRBuffer、1.6μL10mM、dNTPMixture、0.8±0.2μL上游引物、0.8±0.2μL下游引物、0.2±0.2μLDNA模板、14.4±0.6μLddH2O；(2)PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55±2℃退火30s，72℃延伸15±5s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。进一步优选的实施方式是：步骤(1)所述PCR反应体系优选0.2μLrTaqDNAPolymerase、2μL10×PCRBuffer、1.6μL10mMdNTPMixture、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、0.2μLDNA模板、14.4μLddH2O。步骤(2)所述PCR反应程序优选94℃预变性3min；94℃变性30s，55.7℃退火30s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。上述定性检测肠道中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的应用方法中的引物浓度为：拟杆菌属特异性检测引物的上游引物BacterF5与下游引物BacterR6的浓度为5μM，乳杆菌科特异性检测引物的上游引物LacterF5与下游引物LacterR6的浓度为5μM，大肠杆菌特异性检测引物的上游引物E.coliF3与下游引物E.coliR4的浓度为2.5μM，肠球菌属特异性检测引物的上游引物EnterF3与下游引物EnterR4的浓度为2.5μM，链球菌属特异性检测引物的上游引物Stre本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组，由分别用于检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的六组特异性引物对组成；其特征在于：所述用于拟杆菌属检测的引物对是上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6，该对引物扩增获得135bp拟杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，所述上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6的核苷酸序列为：上游引物Bacter F5：5’‑AAGACAACGATGGATAGGGGTT‑3’，下游引物Bacter R6：5’‑TTCACGCTACTTGGCTGGT‑3’；所述用于乳杆菌科检测的引物对是上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6，该对引物扩增获得322bp乳杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，所述上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6的核苷酸序列为：上游引物Lacter F5：5’‑ACAATGGACGCAAGTCTGATG‑3’，下游引物Lacter R6：5’‑ACCGCTACACATGGAGTTCCACWGT‑3’；所述用于大肠杆菌检测的引物对是上游引物E.coli F3与下游引物E.coli R4，该对引物扩增获得416bp大肠杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述上游引物E.coli F3与下游引物E.coli R4的核苷酸序列为：上游引物E.coli F3：5’‑GAACGGTAACAGGAAGCAG‑3’，下游引物E.coli R4：5’‑ATGAACAAAGGTATTAACTTTACT‑3’；所述用于肠球菌属检测的引物对是上游引物Enter F3与下游引物Enter R4，该对引物扩增获得180bp肠球菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；其中，所述上游引物Enter F3与下游引物Enter R4的核苷酸序列为：上游引物Enter F3：5’‑CTTTCGGGTGTCGCTGAT‑3’，下游引物Enter R4：5’‑AGACTTTCGTCCATTGCC‑3’；所述用于链球菌属检测的引物对是上游引物Strep R4与下游引物Strep R3，该对引物扩增获得267bp链球菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；其中，所述上游引物Strep R4与下游引物Strep R3的核苷酸序列为：上游引物Strep F4：5’‑ACAAGATGGACCTGCGTT‑3’，下游引物Strep R3：5’‑TTACCGTCACTGTGTGAACTT‑3’；所述用于双歧杆菌属检测的引物对是上游引物Bifi F3与下游引物Bifi R4，该对引物扩增获得154bp双歧杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；其中，所述上游引物Bifi F3与下游引物Bifi R4的核苷酸序列为：上游引物Bifi F3：5’‑GTCCGGTGTGAAAGTCCATC‑3’，下游引物Bifi R4：5’‑GTAACGGCCCAGAGACCT‑3’。...

【技术特征摘要】
1.一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组，由分别用于检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的六组特异性引物对组成；其特征在于：所述用于拟杆菌属检测的引物对是上游引物BacterF5与下游引物BacterR6，该对引物扩增获得135bp拟杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；其中，所述上游引物BacterF5与下游引物BacterR6的核苷酸序列为：上游引物BacterF5：5’-AAGACAACGATGGATAGGGGTT-3’，下游引物BacterR6：5’-TTCACGCTACTTGGCTGGT-3’；所述用于乳杆菌科检测的引物对是上游引物LacterF5与下游引物LacterR6，该对引物扩增获得322bp乳杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；其中，所述上游引物LacterF5与下游引物LacterR6的核苷酸序列为：上游引物LacterF5：5’-ACAATGGACGCAAGTCTGATG-3’，下游引物LacterR6：5’-ACCGCTACACATGGAGTTCCACWGT-3’；所述用于大肠杆菌检测的引物对是上游引物E.coliF3与下游引物E.coliR4，该对引物扩增获得416bp大肠杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；其中，所述上游引物E.coliF3与下游引物E.coliR4的核苷酸序列为：上游引物E.coliF3：5’-GAACGGTAACAGGAAGCAG-3’，下游引物E.coliR4：5’-ATGAACAAAGGTATTAACTTTACT-3’；所述用于肠球菌属检测的引物对是上游引物EnterF3与下游引物EnterR4，该对引物扩增获得180bp肠球菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；其中，所述上游引物EnterF3与下游引物EnterR4的核苷酸序列为：上游引物EnterF3：5’-CTTTCGGGTGTCGCTGAT-3’，下游引物EnterR4：5’-AGACTTTCGTCCATTGCC-3’；所述用于链球菌属检测的引物对是上游引物StrepR4与下游引物StrepR3，该对引物扩增获得267bp链球菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；其中，所述上游引物StrepR4与下游引物StrepR3的核苷酸序列为：上游引物StrepF4：5’-ACAAGATGGACCTGCGTT-3’，下游引物StrepR3：5’-TTACCGTCACTGTGTGAACTT-3’；所述用于双歧杆菌属检测的引物对是上游引物BifiF3与下游引物BifiR4，该对引物扩增获得154bp双歧杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；其中，所述上游引物BifiF3与下游引物BifiR4的核苷酸序列为：上游引物BifiF3：5’-GTCCGGTGTGAAAGTCCATC-3’，下游引物BifiR4：5’-GTAACGGCCCAGAGACCT-3’。2.权利要求1所述检测六种常见肠道微生物的引物组在利用PCR快速定性检测拟杆菌属、乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔健，郭婷婷，顾心怡，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37