拟南芥中高效CRISPR-CAS9基因编辑载体及构建方法技术

本发明专利技术公开一种拟南芥中高效CRISPR‑CAS9基因编辑载体及构建方法，方法如下，挑选特定N19NGG序列，合成引物对，以pCBC‑DT1T2序列为模板，PCR扩增，用酶切PCR产物以及pEntry‑gRNA序列，回收目的片段，并连接回收产物，得到pEntry‑gRNA‑CRIS‑靶基因质粒，酶切靶基因质粒以及pCambia‑Cas9‑amiR‑RDR6序列，SEQ ID NO.4所示，连接两者回收产物，得到最终序列pCas9‑amiR‑R6‑CRIS‑靶基因，含有该转基因植株会呈现类似rdr6突变体的表型，利用这一点能够筛选出不含转基因质粒的T2代种子植株，植株出现的特定表型选中靶基因被编辑且不含转基因质粒的纯合突变体。本发明专利技术能够显著提高CRISPR‑CAS9编辑效率。

Construction of an efficient CRISPR-CAS9 gene editing vector in Arabidopsis thaliana

The present invention discloses an efficient CRISPR CAS9 gene editing vector and its construction method in Arabidopsis thaliana. The method is as follows: selecting specific N19NGG sequence, synthesizing primer pairs, using pCBC DT1T2 sequence as template, amplifying by PCR, digesting the PCR product and pEntry gRNA sequence, recovering the target fragment, connecting the recovered product, obtaining pEntry gRNA CRIS target gene plasmid, and digesting the target gene plasmid by enzyme. Grains and pCambia_Cas9_amiR_RDR6 sequence, SEQ ID_NO.4, were linked to the recycled products and the final sequence pCas9_amiR_R6_CRIS_target gene was obtained. The transgenic plants with this gene would exhibit a phenotype similar to that of RDR6 mutant. Using this point, T2 seed plants without transgenic plasmids could be screened. The selected target genes were edited and not included in the selected phenotype. Homozygous mutants containing transgenic plasmids. The invention can significantly improve the editing efficiency of CRISPR_CAS9.

【技术实现步骤摘要】
拟南芥中高效CRISPR-CAS9基因编辑载体及构建方法
本专利技术涉及一种拟南芥中高效CRISPR-CAS9基因编辑载体及构建方法。
技术介绍
CRISPR/Cas(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-associatedgenne)是一种获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的手段，广泛存在于细菌和古生菌的基因组中。CRISPR以“重复序列---居间序列---重复序列”这样的形式存在于基因组中，其中的居间序列并非原核生物本身所拥有，而是来自于外源病毒或质粒，用于识别外源基因。而Cas则是与CRISPR序列功能相关的一类基因，负责转录翻译出Cas蛋白。CRISPR/Cas系统根据Cas蛋白的不同而分为I、Ⅱ、Ⅲ三类，由于Ⅰ类和Ⅲ类CRISPR/Cas系统过于复杂，目前主要使用Ⅱ类CRISPR/Cas系统，CRISPR/Cas9即属于Ⅱ类。CRISPR/Cas9作为一种基因定点编辑技术，已在全世界范围内得到广泛应用，是分子育种、基因功能等研究的重要手段。目前CRISPR-CAS9已在人细胞系以及猪、猴、果蝇、斑马鱼、线虫、拟南芥等多种动植物模式生物中进行了精确的基因编辑。目前CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为在动植物中获得突变体的重要手段。典型的CRISPR/Cas9系统由一段人工构建用于识别特定序列的sgRNA序列(single-guideRNA)以及一个核酸内切酶Cas9组成。在植物中，表达效率较高的强启动子如花椰菜病毒(CaMV)35S启动子、泛素(ubiqutin)启动子都被用来构建高效的CRISPR/Cas9编辑系统.。另外，也有研究人员利用专门在囊胚中表达的强启动子来驱动CRISPR/Cas9系统，以此提高CRISPR/Cas9在生物细胞发育早期的编辑效率。即使有这些改良方案，目前所有以农杆菌为媒介的CRISPR/Cas9转基因方法也都面临着转基因沉默的风险。尽管有许多改良CRISPR/Cas9系统的方法，但目前世界上还鲜有通过转录后沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)对CRISPR/Cas9系统进行改良的方法。PTGS现象最早在转基因的矮牵牛(Petunia)中被发现。从转基因位点中产生的小RNA(smallRNA，sRNA)是引发转基因沉默现象的最重要原因。外源转基因序列所产生的部分mRNAs会被RDR6(RNA-dependentRNApolymerase6)蛋白识别，并且RDR6会以该mRNA为模板合成一段双链RNA(dsRNA)。这一段dsRNA进而会被一系列DCL(Dicer-like)核酸内切酶剪切产生siRNAs。最后这些siRNA与AGO(ARGONAUTE)蛋白结合形成沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplexes，RISCs)对含有外源质粒序列的mRNA进行剪切从而造成基因沉默。利用目前主流的的CRISPR/Cas9编辑系统敲除特定基因获得植物纯合突变体时，需要进行大量的DNA提取以及鉴定工作，步骤繁琐耗时巨大。现有的CRISPR-Cas9质粒在宿主细胞内表达都会受到PTGS机制干扰，导致CRISPR-Cas9系统编辑效率降低。作为植物遗传学研究中的最重要材料——拟南芥，在进行诱变获取突变体的过程中也深受其困扰。
技术实现思路
基于以上的不足之处，本专利技术将提供一种拟南芥中高效CRISPR-CAS9基因编辑载体及构建方法，能够有效增加转基因拟南芥植株体内CRISPR/Cas9系统的编辑强度，提高转基因拟南芥植株体内的Cas9蛋白表达量，能够显著地提高CRISPR-CAS9编辑效率。本专利技术所采用的技术如下：一种拟南芥中高效CRISPR-CAS9基因编辑载体，包括pCambia-Cas9-amiR-RDR6序列，如序列表SEQIDNO.4所示。本专利技术还有如下目的，提供一种拟南芥中高效CRISPR-CAS9基因编辑载体的构建方法，补助如下：步骤一：选择CRISPR/Caa9系统编辑的靶基因的所需的gRNA，挑选特定N19NGG序列，合成以下模板引物序列组序列：CRIPSR-F:GAATGGTCTCTATTGN19NGG序列GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT；CRIPSR-R:ATTATTGGTCTCTAAACN19NGG序列CAATCTCTTAGTCGACTCTACCA；步骤二：以pCBC-DT1T2序列为模板，其序列如序列表SEQIDNO.1所示，用模板引物组CRISPR-F/R进行PCR扩增，纯化回收PCR产物；步骤三：用BsaI酶酶切PCR产物以及pEntry-gRNA序列，其序列表SEQIDNO.2所示，回收目的片段，用T4DNA连接酶连接两者的回收产物，得到pEntry-gRNA-CRIS-靶基因质粒；步骤四：用KpnI+EcoRI两个酶酶切pEntry-gRNA-CRIS-靶基因质粒以及pCambia-Cas9-amiR-RDR6序列，其序列如序列表SEQIDNO.4所示，回收目的片段，用T4DNA连接酶连接两者回收产物，得到最终序列pCas9-amiR-R6-CRIS-靶基因；步骤五：利用农杆菌侵染法，将pCas9-amiR-R6-CRIS-靶基因质粒转入植物中，待植株成熟后收集T1代种子，用含潮霉素抗性的培养基筛选T1代种子阳性转基因苗，待T1代种子阳性转基因植株苗成熟后，收集T2代种子；步骤六：T2代种子中含有转基因质粒的拟南芥植株，会呈现特定叶片表型，利用这一点能够筛选出不含转基因质粒的T2代植株，再结合CRISPR/Cas9编辑靶基因后植株出现的特定表型能够选中靶基因被编辑且不含转基因质粒的纯合突变体。本专利技术具有如下优点及有益效果：本专利技术能够抑制拟南芥植株体内PTGS机制的作用，从而提高CRISPR-Cas9的编辑效率。经过本专利技术改良后的CRISPR-Cas9编辑系统能减少大量的鉴定工作，极大地提高实验效率。本专利技术能够有效增加转基因拟南芥植株体内CRISPR/Cas9系统的编辑强度，提高转基因拟南芥植株体内的Cas9蛋白表达量，能够显著地提高CRISPR-CAS9编辑效率。本专利技术能够大大减少实验在筛选纯合突变体时的鉴定工作量。利用传统CRISPR-CAS9技术进行基因编辑时，若需要获得不含CRISPR-CAS9的纯合突变体，则需要实验者对T2代植株进行大量的DNA鉴定工作。含有本专利技术(CRISPR-CAS9-amiR-RDR6质粒)的转基因拟南芥植株会呈现类似rdr6突变体的表型，rdr6突变体叶片向下卷曲，通过该表型即可判断T2代植株中是否含有转基因质粒，再结合目的纯合突变体特有的表型即可判断植株是否为不含CRISPR-CAS9的纯合突变体。这里以gl1突变体为例，如图4所示，当我们想从T2代植株中获得不含CRISPR-CAS9质粒的纯合突变体时，我们首先利用叶片的表型找到不含CRISPR-CAS9质粒的植株，然后再结合gl1突变体没有表皮毛的特点，从不含CRISPR-CAS9质粒的植株中找到没有表皮毛的植株，该植株就是我们所需的纯合突变体。附图说明图1为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拟南芥中高效CRISPR‑CAS9基因编辑载体，其特征在于：包括pCambia‑Cas9‑amiR‑RDR6序列，如序列表SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种拟南芥中高效CRISPR-CAS9基因编辑载体，其特征在于：包括pCambia-Cas9-amiR-RDR6序列，如序列表SEQIDNO.4所示。2.一种拟南芥中高效CRISPR-CAS9基因编辑载体的构建方法，其特征在于，方法如下：步骤一：选择CRISPR/Caa9系统编辑的靶基因的所需的gRNA，挑选特定N19NGG序列，合成以下模板引物组序列：CRIPSR-F:GAATGGTCTCTATTGN19NGG序列GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTCRIPSR-R:ATTATTGGTCTCTAAACN19NGG序列CAATCTCTTAGTCGACTCTACCA；步骤二：以pCBC-DT1T2序列为模板，其序列如序列表SEQIDNO.1所示，用模板引物组CRISPR-F/R进行PCR扩增，纯化回收PCR产物；步骤三：用BsaI酶酶切PCR产物以及pEntry-gRNA序列，其序列表SEQIDNO.2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓彦，陆佳运，劳康文，王碎抗，莫小为，许欣桐，陈雪梅，莫蓓莘，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44