抗体人源化改造方法技术

本发明专利技术公开一种抗体人源化改造方法，使用N‑糖苷酶处理抗体人源化改造过程中的经纯化后的IgG抗体蛋白；所述N‑糖苷酶为PNGaseF酶，所述PNGaseF酶特异性识别蛋白中的序列Asn‑X‑Ser/Thr，完全去除糖基化的同时保留抗体蛋白中的二硫键；X代表除了脯氨酸外任意一种氨基酸。本发明专利技术还提供上述方法的具体应用。本发明专利技术的方法能够有效的对现有技术中部分抗体在抗体人源化改造后期时仍存在的无法替换的氨基酸进行替换。通过上述方法，可以尽可能多的保留经过筛选且合适的人源序列、降低免疫反应的目的，同时又能够最大限度的保留其特异性和亲和力，从而达到合理的人源化的效果。

【技术实现步骤摘要】
抗体人源化改造方法
本专利技术属于分子生物学中抗体人源化设计研究领域，尤其是涉及到利用N-糖苷酶来去除可能影响到抗体互补决定区构象的N-糖基，以维持抗体分子的单一度和纯净度。
技术介绍
目前，抗体人源化设计作为一种新的研发趋势，已经成为了当今治疗性抗体研发的过程中的重要环节。抗体人源化：是一个复杂的过程，主要通过分子生物学实验手段，辅以计算机对抗体蛋白质结构的预测和模拟，使鼠源单克隆抗体序列改造为与人源抗体序列尽可能相近的一种分子生物学操作方法。通过这种方法改造成功后的抗体，既保留了原本鼠源抗体的亲和力和特异性，又降低了对人体造成的免疫副反应。但是在这个过程中，由于单克隆抗体蛋白分子结构的不完全确定性，或由于其分子结构本身的缺陷(如天然存在的糖基化的位点，空间结构中不合适的半胱氨酸的分布，还有一些容易导致脱酰胺作用出现的位点)，导致了不是所有的抗体蛋白都能被顺利的人源化。人源化抗体：是经由抗体人源化处理后的一种产物，一般包括嵌合抗体，改型抗体，表面重塑抗体和全人源化抗体等。处理后的抗体由于其大部分氨基酸序列被人源序列取代，所以对人体造成的免疫副反应有一定程度的降低。糖基化：是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰方式之一，在蛋白质的翻译调控和降解中起到非常重要的作用。在已有的商业化抗体药物中和在研的抗体药物中均发现带有糖基化。根据蛋白质和对应糖链的连接方式，可大致分为N-连接，O-连接，C-甘露糖这三种基本糖基化形式，再外加糖基磷脂酰肌醇锚定连接这种特殊形式。其中与本专利技术密切相关的是抗体蛋白结构中有较高概率存在的N-连接糖基化。N-连接糖基化：是一种新生肽链的糖基化修饰形式。糖通过与肽链中的天冬酰胺的自由NH2基团连接，主要的表现形式为Asn-X-Ser/Thr(X代表除了脯氨酸外任意一种氨基酸)结构的Asn酰胺基氨基与寡糖链(GlcNAC的β-羟基)N-连接糖蛋白。因此，将这种糖基化称为N-连接的糖基化。根据他们的外层链结构的不同，可分为：高甘露糖型，杂合型，复合型三种。它们的区别是，高甘露糖型只含有多个α-连接的甘露糖残基，复杂型含有以岩藻糖，半乳糖和唾液糖为组分的糖链残基，杂合型则同时具有以上两种特点。就现有技术而言，在抗体人源化改造过程中，部分抗体的关键区域仍存在无法替换的氨基酸，无法完成最后的人源化步骤。现有技术难以有效解决这一问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种抗体人源化改造方法，能有效的对现有技术中部分抗体在抗体人源化改造后期时仍存在的无法替换的氨基酸进行替换。通过上述方法，可以尽可能多的保留经过筛选且合适的人源序列、降低免疫反应的目的，同时又能够最大限度的保留其特异性和亲和力，从而达到合理的人源化的效果。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种抗体人源化改造方法，使用N-糖苷酶处理抗体人源化改造过程中的经纯化后的IgG抗体蛋白；所述N-糖苷酶为PNGaseF酶，所述PNGaseF酶特异性识别蛋白中的序列Asn-X-Ser/Thr，完全去除糖基化的同时保留抗体蛋白中的二硫键；X代表除了脯氨酸外任意一种氨基酸。具体的，所述PNGaseF酶为RapidTMPNGaseF酶。比如，RapidTMPNGaseF：NEWENGLANDInc.Catalog#P0710S是一个由英国NEB公司开发，经人工基因克隆重组和表达纯化而得的一个商品化生物制品。本专利技术使用的PNGaseF酶，是一种通过生物工程手段生产的N-糖苷酶。这种酶能够在一定条件下，对融合蛋白(包括抗体)进行去糖基化处理，将N-糖苷从蛋白质上完整切除。在本专利技术中，N-糖苷主要是指单克隆抗体蛋白中存在的N-糖苷，尤其是暴露在CDR构象表面的残基。这种酶类物质在一定的条件下，可以迅速而无偏嗜地去除所有的复合型，杂合型及高甘露糖型糖链，除非其核心结构上有α1-3盐藻糖。在本专利技术中，合理的使用这种N-糖苷酶来作为去糖基化的手段，可以尽可能的保持蛋白质的构象的单一性。对本专利技术而言，尤其是保留了抗体蛋白质三级结构中的非还原性状态，这种状态有利于后续下游检测实验的展开。本专利技术中使用的N-糖苷酶特征详解如图1所示。具体的，PNGaseF酶处理的反应温度为37～55℃；优选为，50℃。具体的，PNGaseF酶处理的反应时间为10～15min。具体的，所述去除糖基化是指去除暴露在抗体蛋白的CDR构象表面的N-糖苷残基。具体的，PNGaseF酶处理的酶切反应体系为：5ul反应底物，2ulRapidPNGaseFBuffer(5X)，3ul的DNase&RNaseFree无菌水，1ul的RapidTMPNGaseF酶，共计11ul的反应体系。具体的，PNGaseF酶处理完成之后用SDS-PAGE方法或质谱仪对酶切效果进行鉴定。使用SDS-PAGE的方法验证的原理在于酶切前后的IgG抗体蛋白的分子量大小(KD，千道尔顿)会发生轻微改变。这种改变会体现在凝胶中条带的相对位置。通过比较样品管和对照(见实施例中的样品管和对照管)可以确认RapidTMPNGaseF酶是否已完整切除IgG抗体蛋白上所连接的N-糖苷。使用质谱仪对酶切反应前后的样品进行检测，如图2所示。本专利技术提供的抗体人源化改造方法，还可以用于以下用途：1.通过使用N-糖苷酶切除鼠源抗体可变区的N-糖苷以改造鼠源抗体的生物物理性质。2.通过使用N-糖苷酶切除鼠源抗体可变区的N-糖苷以确认鼠源抗体所连接的N-糖苷是否参与与抗原的结合。3.通过使用N-糖苷酶切除鼠源抗体可变区的N-糖苷以判断该鼠源抗体是否可以用于人源化。4.通过使用N-糖苷酶切除鼠源抗体可变区的N-糖苷以简化人源化流程并减少人源化流程的总花费。5.通过使用N-糖苷酶切除已人源化的抗体可变区的N-糖苷以改造人源化后的抗体的生物物理性质。本专利技术提供的抗体人源化改造方法，能够通过改造抗体表面进而对带有N-糖苷的抗体的人源化进程产生重要的影响。本专利技术的方法通过挽救部分CDR区无法再替换氨基酸位点的抗体，在尽力保留人源序列的条件下，尽可能的保留高亲和力以及降低免疫原性。其次，本专利技术的方法减少了抗体重复建模和表达试错的时间。用这种方法处理的抗体，由于保留了其三级结构，经过粗略定量后，可以直接送到下游进行后续的各类亲和力检测，有利于快速得到结果。本专利技术的方法中酶切IgG样品中的酶及其缓冲液(这里指RapidTMPNGaseF)由于不含甘油，对下游检测实验的干扰影响最小，不增加分析数据所需的额外时间。由于减少了有可能存在的分子构建和细胞表达，节约了抗体人源化过程中的总花费。附图说明图1为本专利技术所使用N-糖苷酶的特征示意图，其中显示，当核心N-乙酰葡糖胺有α1-6岩藻糖与之相连时，PNGaseF可以切断糖苷键。图2为gG经RapidTMPNGaseF处理前后的电喷雾电离飞行时间质谱分析结果。图3为SDS-PAGE胶鉴定结果，其中可清晰看出样品管在经过RapidTMPNGaseF酶切后条带的偏移。具体实施方式下面将对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体人源化改造方法，其特征在于，使用N‑糖苷酶处理抗体人源化改造过程中的经纯化后的IgG抗体蛋白；所述N‑糖苷酶为PNGaseF酶，所述PNGaseF酶特异性识别蛋白中的序列Asn‑X‑Ser/Thr，去除糖基化的同时保留抗体蛋白中的二硫键；X代表除了脯氨酸外任意一种氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种抗体人源化改造方法，其特征在于，使用N-糖苷酶处理抗体人源化改造过程中的经纯化后的IgG抗体蛋白；所述N-糖苷酶为PNGaseF酶，所述PNGaseF酶特异性识别蛋白中的序列Asn-X-Ser/Thr，去除糖基化的同时保留抗体蛋白中的二硫键；X代表除了脯氨酸外任意一种氨基酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PNGaseF酶为RapidTMPNGaseF酶。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PNGaseF酶处理的反应温度为37～55℃。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，反应温度为50℃。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，PNGaseF酶处理的反应时间为10～15min。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去除糖基化是指去除暴露在抗体蛋白的CDR构象表面的N-糖苷残基。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PNGaseF酶处理的酶切反应体系为：5ul反应底物，2ulRapidPNGaseFBuffer(5X)，3ul的DNase&RNaseFree无菌水，1ul的Rapid...

【专利技术属性】
技术研发人员：高晨阳，陆晓峰，雷鸣，王卓智，李竞，陈智胜，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31