一种虫草素的合成方法技术

本发明专利技术公开的是一种虫草素的合成方法，该方法包括采收成熟蛹虫草子实体，用液氮速冻后快速研磨成粉；加入提取缓冲液，搅拌提取、离心，取上清液用超滤膜截留浓缩；用提取缓冲液稀释置换截留液，浓缩获得酶混合液；向酶混合液中加入底物混合液，得到酶反应体系；将酶反应体系放于适宜温度下反应得到虫草素，本发明专利技术合成方法避免了培养蛹虫草子实体的漫长时间，菌种不易污染，发酵时间短；合成成分简单，纯化方法简单；实现了虫草素的体外仿生合成；绿色无污染，安全健康；酶反应混合物可以重复利用，避免浪费；成本低廉，易于推广。

【技术实现步骤摘要】
一种虫草素的合成方法
本专利技术涉及一种合成方法，更具体一点说，涉及一种虫草素的合成方法，属于生物化学领域领域。
技术介绍
虫草素是蛹虫草的主要生理活性成分，是一种核苷类物质，由腺嘌呤和脱氧戊糖组成，其在医疗保健方面具有很大的市场前景。虫草素的制备主要有化学合成和生物合成两种方式，由于目前化学合成虫草素生产成本高，合成工艺复杂，收率低，产物纯化比较难，所以虫草素主要由生物合成法制备。目前生物合成法制备虫草素有两种途径：一是固体培养基培养获得虫草子实体，再从中提取；二是通过液体培养基发酵蛹虫草菌丝体，从发酵液中直接提取。但是无论是液体发酵还是固体发酵都存在反应时间长，设备要求高，分离纯化步骤繁琐困难的缺点。
技术实现思路
为了解决上述现有技术问题，本专利技术提供具有工艺简单，制备高效，产物纯化简单等技术特点的一种虫草素的合成方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种虫草素的合成方法，其特征在于该合成方法包括如下步骤：A)配制提取缓冲液：将100-150mM醋酸钾，10-30mM醋酸镁，1.5-2μM氯化铁，10-30mMDTT，10-30mMHEPES-KOH混合均匀，调节pH为7.2-7.4；B)配制底物混合液：将100-150mM醋酸钾，10-30mM醋酸镁，1.5-2μM氯化铁，10-30mMDTT，5-10mM腺苷，5-10mMADP，10-30mMATP，0.5-1mMdATP，10-30mMHEPES-KOH混合均匀，调节pH为7.2-7.4；C)制备酶混合液：a)采收成熟蛹虫草子实体，用液氮速冻后快速研磨成粉；b)加入提取缓冲液，置于4℃条件下搅拌提取1-2h，得到预提取液；c)将预提取液置于4℃条件下的离心机内，以12000rpm转速离心10-20min，取上清液并用超滤膜截留浓缩，去滤液；d)用提取缓冲液稀释置换截留液，浓缩获得酶混合液；D)虫草素的合成：将步骤C)获得的酶混合液和步骤B)获得的底物混合液进行混合形成反应液，将反应液置于25℃条件下搅拌反应1-10h，获得虫草素。作为一种改进，步骤b)中所述提取缓冲液的加入量为步骤a)中采收蛹虫草子实体质量的3-10倍(v/m)。作为一种改进，步骤c)中所述超滤膜的规格为3-5kD。作为一种改进，步骤D)中所述底物混合液和酶混合液的体积比为1:0.5-2。作为一种改进，步骤D)中采用磁力搅拌器搅拌。有益效果：1)、现有蛹虫草中存在合成虫草素的酶类，但是具体反应代谢过程难以掌控，本专利技术将蛹虫草中的绝大部分酶类提取出来，加入虫草素反应前提腺苷以及合成虫草素必要的嘌呤等底物进行虫草素的合成，避免了培养蛹虫草子实体的漫长时间，以及菌种易污染，发酵时间长的问题；2)、由于反应体系内没有提供合成其它物质的底物，所以合成成分简单，相比于直接从发酵液以及蛹虫草子实体中提取虫草素的方法，利用该反应体系合成的虫草素纯化方法简单方便；3)、本专利技术通过提取蛹虫草中的酶体系，模仿生理条件实现了虫草素的体外仿生合成；4)、相对于化学合成虫草素的方法，虫草素合成时间短，流程简单，易于操作，避免了化学合成中有机试剂的使用，没有污染，安全健康；5)、本专利技术提供的酶反应混合物可以重复利用，避免浪费；6)、用本专利技术合成虫草素的方法，成本低廉，易于推广。附图说明图1是本专利技术实施例3中反应后高效液相检测虫草素结果图。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术做进一步说明。但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例1一种虫草素的合成方法，其特征在于该合成方法包括如下步骤：A)配制提取缓冲液：将100mM醋酸钾，20mM醋酸镁，2μM氯化铁，30mMDTT，30mMHEPES-KOH混合均匀，调节pH为7.4；B)配制底物混合液：将100mM醋酸钾，20mM醋酸镁，2μM氯化铁，30mMDTT，10mM腺苷，10mMADP，30mMATP，2mMdATP，30mMHEPES-KOH混合均匀，调节pH为7.4；C)制备酶混合液：a)选取成熟的蛹虫草子实体培养45天，采收10g并用液氮速冻后快速研磨成粉；b)加入30ml4℃的提取缓冲液，将液体转入烧杯用磁力搅拌器于4℃条件下搅拌提取1h，得到预提取液；c)将预提取液置于4℃条件下的离心机内，以12000rpm转速离心15min，取上清液并用3kD超滤膜截留浓缩，去滤液；d)用提取缓冲液稀释置换截留液，以去除提取液中残留的虫草素等小分子化合物，将截留液浓缩至10ml，获得的截留液即为酶混合液；D)虫草素的合成：取底物混合液、酶混合液各1ml，进行混合得到合成虫草素的反应液，将反应液置于25℃条件下搅拌反应1h，取反应液用于液相色谱检测(液相色谱检测条件：按NY/T2116-2012的规定进行测定)，反应体系中有虫草素合成，反应结束将反应液用3kD超滤膜超滤，滤液中含有虫草素等小分子，可进一步采用色谱纯化的方法纯化得到虫草素，其中截留液为可以合成虫草素的酶反应体系，可重复利用。实施例2一种虫草素的合成方法，其特征在于该合成方法包括如下步骤：A)配制提取缓冲液：将100mM醋酸钾，10mM醋酸镁，1.5μM氯化铁，10mMDTT，10mMHEPES-KOH混合均匀，调节pH为7.2；B)配制底物混合液：将100mM醋酸钾，10mM醋酸镁，1.5μM氯化铁，10mMDTT，5mM腺苷，5mMADP，10mMATP，0.5mMdATP，10mMHEPES-KOH混合均匀，调节pH为7.2；C)制备酶混合液：a)选取成熟的蛹虫草子实体培养60天，采收10g用液氮速冻后快速研磨成粉；b)加入100ml4℃的提取缓冲液，将液体转入烧杯用磁力搅拌器于4℃条件下搅拌提取2h，得到预提取液；c)将预提取液置于4℃条件下的离心机内，以12000rpm转速离心10min，取上清液并用5kD超滤膜截留浓缩，去滤液；d)用提取缓冲液稀释置换截留液，以去除提取液中残留的虫草素等小分子化合物，将截留液浓缩至10ml，获得的截留液即为酶混合液；D)虫草素的合成：取2ml底物混合液以及1ml酶混合液，进行混合得到合成虫草素的反应液，将反应液置于25℃条件下搅拌反应3h，取反应液用于液相色谱检测(液相色谱检测条件：按NY/T2116-2012的规定进行测定)，反应体系中有虫草素合成，反应结束将反应液用5kD超滤膜超滤，滤液中含有虫草素等小分子，可进一步采用色谱纯化的方法纯化得到虫草素，其中截留液为可以合成虫草素的酶反应体系，可重复利用。实施例3一种虫草素的合成方法，其特征在于该合成方法包括如下步骤：A)配制提取缓冲液：将150mM醋酸钾，30mM醋酸镁，2μM氯化铁，10mMDTT，10mMHEPES-KOH混合均匀，调节pH为7.4；B)配制底物混合液：将150mM醋酸钾，30mM醋酸镁，2μM氯化铁，10mMDTT，5mM腺苷，5mMADP，10mMATP，0.5mMdATP，10mMHEPES-KOH混合均匀，调节pH为7.4；C)制备酶混合液：a)选取成熟的蛹虫草子实体培养75天，采收10g并用液氮速冻后快速研磨成粉；b)加入50ml4℃的提取缓冲液，将液体转入烧杯用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种虫草素的合成方法，其特征在于该合成方法包括如下步骤：A)配制提取缓冲液：将100‑150mM醋酸钾，10‑30mM醋酸镁，1.5‑2μM氯化铁，10‑30mM DTT，10‑30mM HEPES‑KOH混合均匀，调节pH为7.2‑7.4；B)配制底物混合液：将100‑150mM醋酸钾，10‑30mM醋酸镁，1.5‑2μM氯化铁，10‑30mM DTT，5‑10mM腺苷，5‑10mM ADP，10‑30mM ATP，0.5‑2mM dATP，10‑30mM HEPES‑KOH混合均匀，调节pH为7.2‑7.4；C)制备酶混合液：a)采收成熟蛹虫草子实体，用液氮速冻后快速研磨成粉；b)加入提取缓冲液，置于4℃条件下搅拌提取1‑2h，得到预提取液；c)将预提取液置于4℃条件下的离心机内，以12000rpm转速离心10‑20min，取上清液并用超滤膜截留浓缩，去滤液；d)用提取缓冲液稀释置换截留液，浓缩获得酶混合液；D)虫草素的合成：将步骤C)获得的酶混合液和步骤B)获得的底物混合液进行混合形成反应液，将反应液置于25℃条件下搅拌反应1‑10h，获得虫草素。

【技术特征摘要】
1.一种虫草素的合成方法，其特征在于该合成方法包括如下步骤：A)配制提取缓冲液：将100-150mM醋酸钾，10-30mM醋酸镁，1.5-2μM氯化铁，10-30mMDTT，10-30mMHEPES-KOH混合均匀，调节pH为7.2-7.4；B)配制底物混合液：将100-150mM醋酸钾，10-30mM醋酸镁，1.5-2μM氯化铁，10-30mMDTT，5-10mM腺苷，5-10mMADP，10-30mMATP，0.5-2mMdATP，10-30mMHEPES-KOH混合均匀，调节pH为7.2-7.4；C)制备酶混合液：a)采收成熟蛹虫草子实体，用液氮速冻后快速研磨成粉；b)加入提取缓冲液，置于4℃条件下搅拌提取1-2h，得到预提取液；c)将预提取液置于4℃条件下的离心机内，以12000rp...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈剑清，吕雅雯，朱俊德，盖其静，
申请(专利权)人：杭州科迪赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33