一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法及其应用，表达载体、表达系统及其制备方法技术方案

本发明专利技术涉及一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法及其应用，表达载体、表达系统及其制备方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术中的方法应用CHO细胞内源miRNAs与3′‑UTR转录区互补结合来对筛选标记基因表达进行负性调节，进而提高目的基因的表达量。将miRNAs与3′‑UTR转录区克隆到筛选标记基因的下游，构建真核表达载体；然后将目的基因克隆到真核表达载体获得重组表达载体，然后将其转染细胞，获得CHO细胞表达系统，实现目的基因的高效表达。本发明专利技术的CHO细胞表达系统，可以显著提高目的基因在CHO细胞中的表达水平，实现目的蛋白在CHO细胞的高产量稳定表达。

【技术实现步骤摘要】
一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法及其应用，表达载体、表达系统及其制备方法
本专利技术涉及一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法及其应用，表达载体、表达系统及其制备方法，属于基因工程

技术介绍
重组蛋白质是应用重组DNA或重组RNA的技术从而获得的蛋白质，是指应用基因克隆或化学合成技术，获得目的基因，连接到适合的表达载体，导入到特定的宿主细胞，表达出蛋白分子。其中重组药物蛋白是生物药物的重要组成部分，包括重组蛋白、重组药物蛋白基因工程抗体、治疗性疫苗等。结构复杂或糖基化对于蛋白质的活性非常重要，哺乳动物细胞由于具备类似于人类细胞的翻译后加工修饰(post-translationalmodifications，PTMs)，因此，哺乳动物细胞表达系统是目前重组药物蛋白生产的重要平台。在所用的哺乳动物细胞中，其中近70％都是中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞。然而，由于CHO细胞目的蛋白表达水平低、筛选高产稳定的细胞周期长、细胞培养成本高等因素限制了重组药物蛋白的生产。由于转基因转染细胞后的随机整合，转基因常发生沉默或者表达水平较低，需要从大量细胞克隆株才能分离出稳定高效表达的克隆细胞株，给基因工程的产业化生产带来很大的困难。此外，在CHO细胞表达系统中，高水平持续稳定表达的细胞株往往难以得到，这是因为转基因转染细胞后的随机整合使有些转基因发生沉默或者表达水平降低，因此需要从大量细胞克隆株中分离出稳定高效表达的克隆细胞株，这也给基因工程产业化生产带来了很大困扰(Astudyofmonoclonalantibody-producingCHOcelllines:whatmakesastablehighproducer？Biotechnol.Bioeng.2009)。近年来，研究人员围绕提高CHO细胞重组蛋白表达水平做了大量的工作。现有技术中，申请公布号为CN106520832A的中国专利技术专利申请公开了双顺反子表达载体、表达系统、制备方法及应用，该表达载体上包含核基质结合区序列，能克服基因沉默，实现转基因在宿主细胞中的高效、长期表达。申请公布号为CN104975018A的中国专利技术专利申请公开了一种新型增强子及其应用，其技术方案是将增强子添加于哺乳动物细胞的重组蛋白表达载体，用于增强启动子转录活性强度，进而增强哺乳动物或其他来源蛋白质的分泌表达。申请公布号为CN106701823A的中国专利技术专利申请公开了一种生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立及其应用，其技术方案是利用CRISPR/Cas9技术编码CHO细胞的FUT8基因，得到FUT8基因沉默的CHO细胞株，通过FUT8/细胞表达抗体与抗原的亲和力提高7倍。申请公布号为CN107828738A的中国专利技术专利申请公开了一种DNA甲基转移酶缺陷型CHO细胞系及其制备方法的应用，其技术方案是利用CRISPR/Cas9技术敲除CHO细胞DNA甲基转移酶Dnmt3a基因，筛选得到DNA甲基转移酶缺陷型CHO细胞。通过宿主CHO细胞遗传改造重组基因CHO细胞表达系统，进而提高重组蛋白的表达水平和表达稳定性。但是上述现有技术中的方法在构建重组基因表达筛选系统时，要么是通过增加外源的表达调控元件，如核基质结合区序列、增强子，要么是通过基因敲除内源基因序列，如FUT8基因、DNA甲基转移酶Dnmt3a基因，但都没有从细胞内源的调控元件入手，更没有通过细胞内源性的调控元件减弱筛选标记，提高筛选的严谨性来提高转基因表达。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法。该方法利用内源性miRNA抑制筛选标记基因表达可以提高重组基因表达筛选系统的严谨性的特性，进而提高CHO细胞中重组蛋白的表达量。本专利技术还提供了上述提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法在筛选3′-UTR转录区序列中的应用。该应用可以筛选出与内源miRNAs特异性结合较好的3′-UTR转录区序列，筛选得到的3′-UTR转录区序列可以抑制筛选标记基因的表达，进而促进目的基因的高效表达。本专利技术还提供了一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的真核表达载体，该真核表达载体利用内源性miRNA抑制筛选标记基因表达可以提高重组基因表达筛选系统的严谨性的特性，进而提高CHO细胞中重组蛋白的表达量。本专利技术还提供了上述表达载体的制备方法，使用该方法可以制备得到上述的真核表达载体。本专利技术还提供了一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的重组表达载体，该重组表达载体利用内源性miRNA抑制筛选标记基因表达，促进目的基因的高效表达，转入CHO细胞后可以利用CHO细胞表达系统提高重组蛋白的表达量。本专利技术还提供了上述重组表达载体的制备方法，使用该方法可以制备得到上述的重组表达载体。本专利技术还提供了一种CHO细胞表达系统，该细胞表达系统利用内源性miRNA抑制筛选标记基因表达，促进目的基因的高效表达，可以提高重组基因表达筛选系统的严谨性的特性，进而提高CHO细胞中重组蛋白的表达量。本专利技术还提供了上述CHO细胞表达系统的制备方法，通过该制备方法可以获得上述的CHO细胞表达系统。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，包括以下步骤：(1)将与CHO细胞内源miRNAs序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列克隆到表达载体的筛选标记基因的下游，构建真核表达载体；(2)将目的基因克隆到真核表达载体上，构建重组表达载体；(3)将重组表达载体转染到CHO细胞中，培养并筛选，得到CHO细胞表达系统；(4)对CHO细胞表达系统进行诱导表达，得到目的蛋白。miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其可通过剪切mRNA和抑制蛋白质翻译两种方式负性调控其靶基因，其主要的作用机制为miRNA与靶mRNA的3′-端非翻译区(3′-untranslatedregion,3′-UTR)结合，从而影响mRNA的稳定性或抑制蛋白的翻译。本专利技术的提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法中，将含有CHO细胞内源性的高丰度、恒定表达的miRNA靶点的3′-UTR序列融合到筛选标记基因上，构建CHO细胞的重组蛋白表达载体，进而获得含有该重组蛋白表达载体的CHO细胞表达系统，最终实现目的基因在CHO细胞中的高效表达。本专利技术的方法主要通过细胞内源丰富的miRNA(在CHO细胞中含量较多的miRNA)的3′-UTR抑制筛选标记基因表达，进而提高CHO细胞目的基因的表达。优选的，所述CHO细胞内源miRNAs序列可以为hsa-let-7f(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)、bta-miR-21、hsa-miR-25中的任意一种。本专利技术中选择的hsa-let-7f、bta-miR-21、hsa-miR-25序列为CHO细胞中具有高丰度，并且较为恒定、随培养条件变化较低的miRNAs，以其为与3′-UTR靶点结合的miRNAs序列具有更好的提高的重组蛋白的表达量的效果。优选的，当所述CHO细胞内源miRNAs序列为hsa-let-7f时，与该序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列为如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将与CHO细胞内源miRNAs序列互补结合的mRNA靶基因的3′‑UTR转录区序列克隆到表达载体的筛选标记基因的下游，构建真核表达载体；（2）将目的基因克隆到真核表达载体上，构建重组表达载体；（3）将重组表达载体转染到CHO细胞中，培养并筛选，得到CHO细胞表达系统；（4）对CHO细胞表达系统进行诱导表达，得到目的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将与CHO细胞内源miRNAs序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列克隆到表达载体的筛选标记基因的下游，构建真核表达载体；（2）将目的基因克隆到真核表达载体上，构建重组表达载体；（3）将重组表达载体转染到CHO细胞中，培养并筛选，得到CHO细胞表达系统；（4）对CHO细胞表达系统进行诱导表达，得到目的蛋白。2.根据权利要求1所述的提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述CHO细胞内源miRNAs序列可以为hsa-let-7f、bta-miR-21、hsa-miR-25中的任意一种。3.根据权利要求2所述的提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，其特征在于：当所述CHO细胞内源miRNAs序列为hsa-let-7f时，与该序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列为如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4中所示序列中的任意一种。4.如权利要求1所述的提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法在筛选3′-UTR转录区序列中的应用，其特征在于：包括以下步骤：（1）将两个以上待选的3′-UTR转录区序列分别克隆到表达载体的筛选标记基因的下游，构建与待选的3′-UTR转录区序列数量对应的真核表达载体；所述待选的3′-UTR转录区序列为与CHO细胞内源miRNAs序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列；（2）将目的基因分别克隆到真核表达载体上，构建重组表达载体；（3）将重组表达载体分别转染到CHO细胞中，培养并筛选，得到CHO细胞表达系统；（4）对CHO细胞表达系...

【专利技术属性】
技术研发人员：林重超，王天云，郭潇，赵春澎，倪天军，林艳，王燕芳，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41