一种动物克隆胚胎培养液及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种动物克隆胚胎培养液及培养方法：按照50～100μM将牛磺熊去氧胆酸添加到胚胎基础培养液中，得到胚胎培养液；将通过核移植获得的动物克隆胚胎移入所述胚胎培养液中进行培养。本发明专利技术利用牛磺熊去氧胆酸在核移植后的培养阶段显著的抑制动物克隆胚胎的内质网应激，同时，显著的提高动物克隆胚胎的体外发育率。本发明专利技术对提高动物克隆胚胎的体外培养效率，特别是对于获得基因修饰兔和克隆兔，具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种动物克隆胚胎培养液及培养方法
本专利技术涉及体外胚胎培养，具体涉及动物克隆胚胎培养液及培养方法。
技术介绍
核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中并得到重构胚胎的细胞工程技术。该技术在构建基因修饰动物、拯救濒临灭绝物种、干细胞治疗以及线粒体治疗等领域中具有重要的价值。目前体细胞核移植效率处于极低的水平。核移植获得的重构胚胎不同于受精胚胎，在构建胚胎的过程中涉及到显微操作过程(去核、注核、融合和激活)，核移植操作的刺激能够导致诱导细胞发生内质网应激。体外培养条件的刺激也会导致诱导细胞发生内质网应激，持续的内质网应激不利于核移植获得的重构胚胎的发育，往往导致胚胎发育阻滞和早期胚胎死亡。当细胞受到外界的某些刺激时，内质网会产生一系列调节机制，形成内质网应激，失调的内质网应激会导致凋亡通路的激活，并导致核移植胚胎基因表达异常，从而使得核移植胚胎表现出发育阻滞和早期胚胎死亡的现象。胚胎发育率以及胚胎囊胚期总细胞数、细胞凋亡水平是主要的用于评价胚胎发育质量的指标。在进行体细胞核移植时，去核、融合、激活等操作以及胚胎培养都会造成动物克隆胚胎发生内质网应激和氧化应激，目前并没有专门针对动物克隆胚胎的体外培养液，特别是在基因编辑兔以及体细胞核移植兔的克隆胚胎培养中，亟待提出能够抑制克隆胚胎发生的内质网应激，以及提高动物克隆胚胎发育率的培养液及培养方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种动物克隆胚胎培养液及培养方法，可以提高动物克隆胚胎的体外培养效率。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种动物克隆胚胎培养液，该胚胎培养液包括胚胎基础培养液以及内质网应激抑制剂，所述内质网应激抑制剂为具有内质网应激抑制作用的胆汁酸或其衍生物，所述胚胎培养液中内质网应激抑制剂的浓度为50～100μM。优选的，所述胚胎基础培养液包括用于模拟动物(例如，兔子)输卵管液的理化特征的无机盐组分、有机盐组分、氨基酸组分、葡萄糖及血清白蛋白(例如，牛血清白蛋白)。优选的，所述胚胎基础培养液所含无机盐组分具体包括1.780～1.790mM的CaCl2·2H2O、1.510～1.520mM的MgSO4·7H2O、7.160～7.170mM的KCl、1.190～1.200mM的KH2PO4、25.000～25.010mM的NaHCO3以及107.590～107.690mM的NaCl。优选的，所述胚胎基础培养液所含有机盐组分具体包括0.393～0.403mM的丙酮酸钠、4.053～4.063mM的乳酸钠以及0.340～0.350mM的柠檬酸钠。优选的，所述胚胎基础培养液所含氨基酸组分具体包括0.080～0.090mM的丙氨酸、0.190～0.199mM的精氨酸、0.120～0.129mM的天冬酰胺、0.100～0.112mM的天冬氨酸、0.120～0.132mM的胱氨酸、0.090～0.100mM的谷氨酸、0.680～0.689mM的谷氨酰胺、3.000～3.035mM的甘氨酸、0.050～0.055mM的组氨酸、0.020～0.031mM的羟脯氨酸、0.280～0.291mM的异亮氨酸、0.440～0.451mM的亮氨酸、0.260～0.273mM的赖氨酸、0.110～0.121mM的蛋氨酸、0.130～0.139mM的苯丙氨酸、0.100～0.112mM的脯氨酸、0.150～0.156mM的丝氨酸、0.260～0.272mM的苏氨酸、0.050～0.059mM的色氨酸、0.130～0.139mM的酪氨酸以及0.260～0.270mM的缬氨酸。优选的，所述胚胎基础培养液所含葡萄糖的浓度为2.770～2.780mM，胚胎基础培养液所含血清白蛋白的浓度为60～80g/L。优选的，所述内质网应激抑制剂选自牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)。一种动物克隆胚胎培养方法，包括以下步骤：1)将内质网应激抑制剂添加到上述胚胎基础培养液中，得到胚胎培养液，所述内质网应激抑制剂为具有内质网应激抑制作用的胆汁酸或其衍生物，所述胚胎培养液中内质网应激抑制剂的浓度为50～100μM；2)将通过核移植获得的动物(例如，兔子)克隆胚胎移入所述胚胎培养液中进行培养。优选的，所述步骤2)中，核移植采用电融合方式，受体细胞选自动物(例如，兔子)的去核卵母细胞，供体细胞选自动物(例如，兔子)的卵丘细胞。优选的，所述步骤2)具体包括以下步骤：将所述胚胎培养液制作微滴并覆盖石蜡油，然后置于38.5℃、CO2体积分数为5％及完全相对湿度的培养箱中进行平衡以用于胚胎培养，将经过注核、融合、激活后获得的动物克隆胚胎移入经过平衡后的胚胎培养液的微滴中，并继续置于所述培养箱中进行培养。本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术通过选择一定的内质网应激抑制剂作为培养液添加成分，可通过核移植后的培养阶段显著的抑制动物克隆胚胎的内质网应激，同时，发现能够显著的提高动物克隆胚胎的体外发育率。本专利技术对提高动物克隆胚胎的体外培养效率，特别是对于获得基因修饰兔和克隆兔，具有重要的应用价值。进一步的，本专利技术将化合物牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)添加到培养液中，该化合物能够有效抑制胚胎细胞发生的内质网应激，且获得最佳的动物克隆胚胎发育率和质量。进一步的，所述胚胎基础培养液从模拟动物输卵管液的理化特征角度出发进行组分优化，从而确定无机盐组分、有机盐组分、氨基酸组分等的组成，模拟体内发育微环境，更好的促进动物克隆胚胎的体外发育。同时，使本专利技术更加适应工业化体外胚胎培养需求。附图说明图1为CHOP和GRP78在对照组和TUDCA组克隆兔胚胎(囊胚时期)中的mRNA表达水平：上标字母不同表示差异显著。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做详细说明，所述实施例仅用于解释本专利技术，而不是对本专利技术保护范围的限制。1.试剂的来源和制备注射用绒促性素(HCG)购自宁波市三生药业有限公司；灭菌注射用水购自芮城县维尔富兽药有限公司；戊巴比妥钠购自Merck公司。DPBS、PBS均购自Hyclone公司。PBS-PVA、细胞松弛素B、透明质酸酶、胰酶、TUDCA、6-二甲氨基嘌呤、M199培养液、DMEM均为sigma产品。电融合液为Btx产品。固定液、TritonX-100、Hoechst33342均为碧云天产品。FBS为Gibco产品。胚胎培养液(记为A液)的配方，由以下(1)、(2)、(3)及(4)中的组分构成，采用超纯水配制，作为基础培养液：(1)CaCl2·2H2O1.780mM、MgSO4·7H2O1.510mM、KCl7.160mM、KH2PO41.190mM、NaHCO325.000mM，以及NaCl107.590mM；(2)丙酮酸钠(C3H3NaO3)0.393mM、乳酸钠(C3H5NaO3)4.053mM，以及柠檬酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)0.340mM；(3)丙氨酸0.080mM、精氨酸0.190mM、天冬酰胺0.120mM、天冬氨酸0.100mM、胱氨酸0.120mM、谷氨酸0.090mM、谷氨酰胺0.680mM、甘氨酸3.000mM、组氨酸0.050mM、羟脯氨酸0.020mM、异亮氨酸0.280mM、亮氨酸0.440mM、赖氨酸0.260mM、蛋氨酸0.110mM、苯丙氨酸0.130mM、脯氨酸0.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：该胚胎培养液包括胚胎基础培养液以及内质网应激抑制剂，所述内质网应激抑制剂为具有内质网应激抑制作用的胆汁酸或胆汁酸衍生物，胚胎培养液中内质网应激抑制剂的浓度为50～100μM。

【技术特征摘要】
1.一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：该胚胎培养液包括胚胎基础培养液以及内质网应激抑制剂，所述内质网应激抑制剂为具有内质网应激抑制作用的胆汁酸或胆汁酸衍生物，胚胎培养液中内质网应激抑制剂的浓度为50～100μM。2.根据权利要求1所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述胚胎基础培养液包括用于模拟动物输卵管液的理化特征的组分。3.根据权利要求1或2所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述胚胎培养液包括以下用于构成所述胚胎基础培养液的组分：无机盐组分、有机盐组分、氨基酸组分、葡萄糖及血清白蛋白。4.根据权利要求3所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述无机盐组分具体包括1.780～1.790mM的CaCl2·2H2O、1.510～1.520mM的MgSO4·7H2O、7.160～7.170mM的KCl、1.190～1.200mM的KH2PO4、25.000～25.010mM的NaHCO3以及107.590～107.690mM的NaCl。5.根据权利要求3所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述有机盐组分具体包括0.393～0.403mM的丙酮酸钠、4.053～4.063mM的乳酸钠以及0.340～0.350mM的柠檬酸钠。6.根据权利要求3所述一种动物克隆胚胎培养液，其特征在于：所述氨基酸组分具体包括0.080～0.090mM的丙氨酸、0.190～0.199mM的精氨酸、0.120～0.129mM的天冬酰胺、0.100～0.112mM的天冬氨酸、0.120～0.132...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘恩岐，屈鹏祥，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61