日本血吸虫CD36相关蛋白的胞外肽段Ex160在制备抗血吸虫虫卵发育疫苗中的应用制造技术

本发明专利技术属于免疫学领域，具体涉及一种日本血吸虫来源的蛋白分子——日本血吸虫CD36相关蛋白(Schistosoma japonicum CD36 related protein，CD36RP)的胞外肽段Ex160在制备抗血吸虫虫卵发育疫苗中的应用。通过蛋白质原核表达技术获得CD36RP胞外段的一段肽Ex160，并用Ex160免疫动物后可诱导动物体内产生稳定的高水平IgG抗体。该抗体可显著抑制血吸虫对宿主血清中脂类的摄取，从而有效抑制血吸虫虫卵的成熟以及宿主肝脏病理反应，提示CD36RP可以作为抗日本血吸虫虫卵发育的疫苗候选分子，具有潜在的临床应用价值；能用于研发抗血吸虫疫苗。

Application of Ex160 Extracellular Peptide of CD36-related Protein of Schistosoma japonicum in the Preparation of Anti-Schistosoma Egg Development Vaccine

The invention belongs to the field of immunology, and specifically relates to the application of Ex160, an extracellular peptide segment of Schistosoma japonicum CD36 related protein (CD36RP), a protein molecule originating from Schistosoma japonicum, in the preparation of an egg development vaccine against Schistosoma japonicum. Ex160, an extracellular segment of CD36RP, was obtained by prokaryotic expression of protein. Immunization with Ex160 could induce stable high level IgG antibodies in vivo. The antibody can significantly inhibit the uptake of lipids in host serum, thus effectively inhibiting the maturation of schistosomiasis eggs and the pathological reaction of host liver. It suggests that CD36RP can be used as a candidate molecule for vaccine against the development of Schistosoma japonicum eggs and has potential clinical application value. It can be used to develop anti-schistosomiasis vaccine.

【技术实现步骤摘要】
日本血吸虫CD36相关蛋白的胞外肽段Ex160在制备抗血吸虫虫卵发育疫苗中的应用
本专利技术属于免疫学领域，具体涉及日本血吸虫CD36相关蛋白(SchistosomajaponicumCD36relatedprotein，CD36RP)的应用。
技术介绍
血吸虫病是当前我国乃至世界最严重的寄生虫病之一。全球有78个国家报道血吸虫病的流行，受感人数2.06亿，其中有52个国家和地区仍然是血吸虫病的中度甚至重度流行区(http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/schistosomiasis.)。在我国，至2017年底，全国有日本血吸虫病流行县(市、区)共450个，总人口2.59亿，有流行村28544个，总人口7032.45万(张丽娟等,《中国血吸虫病防治杂志》，2018网络首发论文)。日本血吸虫病因可造成进行性发展的难以逆转的肝脏免疫病理损害的致病特点，及其与农业经济发展(涉及农村劳动力和牛、猪、羊等多种重要家畜)和水利建设等行业的关系密切，成为影响社会、经济发展的严重公共卫生问题之一(DanielGColleyetal.Lancet2014；383:2253–64)。一方面，血吸虫病之所以能流行，关键环节之一就是虫卵必须发育成熟才能使血吸虫生活史得以延续。血吸虫尾蚴经皮肤或黏膜侵入人或家畜后随血流移行并定居于门静脉-肠系膜静脉血管内，发育为成虫并产出虫卵，虫卵沉积于肠壁及肝脏。沉积于肠壁的虫卵发育成熟后产生的抗原可诱发肠壁产生严重的炎性损伤，成熟虫卵由此可经肠黏膜破溃处落入肠腔并随粪便排出体外。排出的成熟虫卵入水后孵化出卵内毛蚴，毛蚴在水中可于中间宿主钉螺体内进一步发育至感染期尾蚴，尾蚴再次感染人或家畜即可造成血吸虫病的传播甚至流行。而未成熟的虫卵由于卵内毛蚴并未发育成熟，因此未成熟虫卵即使入水也不能成功孵出毛蚴，从而造成血吸虫生活史中断，最终将阻断血吸虫病的传播。因此，建立抑制宿主体内血吸虫虫卵发育成熟的方法对血吸虫病流行的控制具有十分重要的意义。另一方面，日本血吸虫感染后对人和动物最主要的致病作用是沉积在肝脏中的血吸虫虫卵所引起的肝脏免疫病理损伤——肝脏虫卵肉芽肿及其继发的肝纤维化。即寄生于人或动物肝门静脉-肠系膜静脉血管系统中的血吸虫成虫产出的虫卵随血流沉积于肝脏内，成熟虫卵中的毛蚴释放可溶性虫卵抗原(solubleeggantigen，SEA)(未成熟虫卵不能释放SEA)，(LeMingHangetal.ExperimentalParasitology1974；35:288-298)刺激宿主免疫细胞产生免疫应答，在肝脏内形成以虫卵为中心的肉芽肿并继发纤维化，最终导致肝硬化、门脉高压症并引发消化道出血、腹水、肝昏迷等多种严重的继发病症(统称为晚期血吸虫病)，使宿主丧失劳动力、生活自理能力乃至造成死亡等严重后果。一旦人或家畜感染了血吸虫，由于雌虫产卵能力极强，即使患者以化疗清除了体内所有血吸虫成虫，沉积在肝脏中的大量虫卵所释放的SEA仍然在刺激宿主免疫系统，使得肝脏出现新的病理损害。并且，血吸虫病肝脏免疫病理损害具有进行性发展的特点，即使患者接受化疗清除体内成虫，并且沉积在患者肝脏中的虫卵也已死亡、钙化，但肝脏免疫病理损害的进程仍会持续发展，因此即使在许多几十年前早就宣布已经彻底消灭血吸虫的老流行区，上述晚期血吸虫病损害仍然在危害着一部分既往感染者的生命健康。因此针对肝脏病理损害的关键始动和促进因素——虫卵的成熟来防控肝脏病理损害，是有效预防血吸虫感染对人和家畜所致严重后果的关键。综上可见，宿主体内血吸虫虫卵的成熟是血吸虫病流行以及致病的十分关键的环节。成熟的血吸虫虫卵的结构包括外层卵壳和包裹在卵壳内的毛蚴。其中毛蚴既是血吸虫生活史中的必经阶段，也是SEA(血吸虫虫卵导致肝脏免疫病理损害的根本原因)的主要来源，因此毛蚴的成熟是血吸虫卵成熟的关键。血吸虫卵自宿主体内排出时毛蚴已发育成熟，毛蚴的发育经历了在雌虫体内的卵黄的融合，以及虫卵自雌虫体内产出后毛蚴胚胎的发育成熟等阶段，每个阶段所需各类营养物质均需从宿主体内摄取。但是无论是卵黄的融合还是后续胚胎的发育，都十分依赖来源于宿主的脂类营养。研究发现，毛蚴的发育成熟只依赖HDL来源的胆固醇酯(HDL-CE)(KunikoOkumura-Nojietal.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications2001；286:305–310)。因此，阻止血吸虫虫卵中的毛蚴对HDL-CE的摄取，是针对虫卵成熟建立阻断血吸虫流行同时抑制宿主肝脏病理损害的方法的核心所在。脂蛋白上所结合脂类的转运是由胆固醇酯转移蛋白(cholesterylestertransferprotein，CETP)完成的，血吸虫从宿主血浆中摄取HDL-CE同样也依赖CETP。通过将宿主体内雌雄合抱的成虫分离到体外培养，观察虫卵内毛蚴成熟，发现体外用缺乏CETP的血清培养的成虫，产出的虫卵中毛蚴的成熟率显著低于用正常含量CETP的血清培养组。相反，感染了血吸虫的CETP转基因小鼠(持续高表达CETP)，不仅体内血吸虫虫卵中毛蚴的成熟度显著高于正常小鼠，而且肝脏的病理也显著强于正常小鼠。在体外培养成虫时，如果用来源于CETP缺陷血清的HDL来处理，那么成虫产出的虫卵中毛蚴的成熟度将显著低于用正常血清来源的HDL处理组(KunikoOkumura-Nojietal.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications2001；286:305–310)。这些实验结果表明，血吸虫虫卵在宿主体内发育的过程中，需要通过CETP来摄取HDL-CE，以促进卵内毛蚴的成熟。而介导血吸虫摄取HDL-CE的，正是表达于血吸虫中的一种蛋白——CD36相关蛋白(CD36-relatedprotein，CD36RP,GenBank号:mRNAAY496973.1；蛋白质AAS05545.1)。CD36RP是一种跨膜蛋白，mRNA全长1880bp，编码506个氨基酸。CD36RP对HDL的亲和力显著高于其它脂蛋白如LDL，这也正是血吸虫倾向于从HDL上获取脂类用于虫卵成熟的原因。CD36RP在成虫和虫卵表面均有表达，且成虫的表达量显著高于虫卵(KunikoOkumura-Nojietal.FASEBJ.2013；27:1236–1244)。虫卵发育过程中，成虫通过CD36RP摄取宿主血清中的脂类营养用于虫卵形成初期卵黄的融合，如果这一时期的虫卵摄取的脂类足够多，那么随后虫卵从雌虫体内产出，卵内毛蚴继续进行胚胎发育时即使宿主提供的脂类不充足，毛蚴也能顺利发育成熟，因此成虫表面的CD36RP显著多于虫卵。不仅如此，如果虫卵在雌虫体内发育的初期没有摄取足够的脂类，那么当虫卵自雌虫体内排出后，虫卵尚可利用自身表面表达的少量受体继续摄取脂类用于进一步的发育，保证毛蚴成熟。由此可见，虫卵发育的整个过程都依赖脂类营养，并且虫卵在雌虫体内的时期对脂类有更强的需求。以上这些研究，均提示CD36RP可用于制备抗血吸虫虫卵发育的疫苗，在雌虫体内的虫卵发育启动之前、甚至是雌虫发育成熟之前，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.日本血吸虫CD36相关蛋白的胞外肽段Ex160在制备抗血吸虫虫卵发育疫苗中的应用。

【技术特征摘要】
1.日本血吸虫CD36相关蛋白的胞外肽段E...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏川，朱继峰，张丽娜，陈晓军，周莎，李娅琳，横山信治，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32