一种检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于滚环扩增技术和内切酶反馈放大方法检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器，包括：两段适配体DNA序列、线性挂锁探针、连接探针、AP探针、T4 DNA连接酶缓冲液、核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ、PBS缓冲液、dNTP、phi29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV；所述的荧光生物传感器的制备方法：（1）构建环形模板，制备复合探针；（2）复合探针与内切酶、目标物结合，实现信号放大。该探针可实现高特异性及超灵敏性检测；且反应温和、检测快、重复性好。

A fluorescent biosensor for detecting adenosine triphosphate and its preparation method

The invention relates to the field of biosensor technology, in particular to a fluorescent biosensor for detecting adenosine triphosphate based on ring amplification technology and endonuclease feedback amplification method, including two-segment adapter DNA sequence, linear padlock probe, ligation probe, AP probe, T4 DNA ligase buffer, nucleic acid exonuclease I, nucleic acid exonuclease III, PBS buffer, dNTP, phi29 DNA poly. The preparation method of the fluorescent biosensor includes: (1) constructing a ring template to prepare a composite probe; (2) combining the composite probe with the endonuclease and the target substance to achieve signal amplification. The probe has the advantages of high specificity and sensitivity, mild reaction, fast detection and good repeatability.

【技术实现步骤摘要】
一种检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器及其制备方法
本专利技术涉及生物传感器
，特别涉及基于滚环扩增技术和内切酶反馈放大方法检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器，还涉及其制备方法。
技术介绍
三磷酸腺苷（ATP）是一种不稳定的高能量化合物。ATP是生物体中的重要能量物质，能够为各种生命活动提供能量。ATP提供能量的方式是高能磷酸键的分子内水解：当一个分子中的高能磷酸键被水解时释放的能量是正常化学键的两倍以上，高达30.54kJ/mol。因此，ATP在细胞内可以大量储存和转移化学能。在细胞的各种生化反应和代谢中，ATP在提供能量中起重要的作用。所以可以根据其含量的变化进监测生物体的指标。异常的ATP活性会导致局部贫血，帕金森综合症以及低血糖等疾病，并且可以用来评价药物。传统的检测ATP的方法主要有：光学分析法、电泳法、色谱法。但存在一下缺点：检测精度相对较低；检测时间较长，操作复杂；检测仪器昂贵，成本高。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测ATP的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于滚环扩增技术和内切酶反馈放大荧光法检测ATP的生物传感器，还涉及其制备方法。一种检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器，包括：两段适配体DNA序列、线性挂锁探针、连接探针、AP探针、T4DNA连接酶缓冲液、核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ、PBS缓冲液、dNTP、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV；所述的适配体-1的序列如SEQNo.1所示；所述的适配体-2的序列如SEQNo.2所示；所述的线性挂锁探针的序列如SEQNo.3所示；所述的连接探针的序列如SEQNo.4所示；所述的AP探针的序列如SEQNo.5所示。所述的适配体-1的3’端修饰的反向dT。所述的线性挂锁探针5’修饰磷酸基团。所述的AP探针的3’端修饰的反向dT，其中3’端序列第七个碱基上修饰无嘌呤无嘧啶位点。所述的T4DNA连接酶缓冲液为50mMTris-HCl、10mMMgCl2、10mMDTT和1mMATP。所述的PBS缓冲液为10mMNa2HPO4、10mMNaH2PO4、140mMNaCl、1mMKCl、1mMMgCl2、1mMCaCl2、pH=7.4。上述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）构建环形模板，制备复合探针；（2）复合探针与内切酶、目标物结合，实现信号放大。所述的步骤（1），包括以下步骤：S1将线性挂锁探针与连接探针加入到T4DNA连接酶缓冲液，灭活体系中的T4DNA连接酶；S2加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，得到环形模板，4℃条件下保藏；S3向环形模板中加入适配体-1、PBS缓冲液，孵育，得到复合探针I；向环形模板中加入无嘌呤无嘧啶探针，孵育，得到复合探针II。所述的步骤（2）的过程为：将复合探针I、dNTP、复合探针II、适配体-2、phi29DNA聚合酶、NMM溶液、核酸内切酶IV、缓冲液混合，加入目标物ATP，恒温反应。所述的NMM为N-methylmesoporphyrinIX的缩写，所示的NMM溶液为：称取NMM粉末0.0009g，溶于90μL二甲基亚砜中，于-20℃保存。所述的缓冲液为Phi29DNA聚合酶的缓冲液，含有50mMTris-HCl、10mMMgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mMDTT，pH7.5。所述的步骤（2）中，核酸内切酶IV最低浓度为0.5U/μL；phi29DNA聚合酶最低浓度为1U/μL；NMM的最低浓度为2.4μM。所述的恒温反应的温度为37℃，时间大于等于90min。本专利技术中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：适配体-1:CACACGAATTCATCTGTTTTTTACCTGGGGGAGTAT-InverteddT；适配体-2:TGCGGAGGAAGGTTTTTTTGGGTATTTTTTTTTTTTACTCTTCCTAGCT；线性挂锁探针:P-ATTCGTGTGTAGCTTACATGGCTTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTTTAGCTTACATGGCTTTTCCCAACCCGCCCTACCCCAGATGA；连接探针:CACACGAATTCATCTG；AP探针:CACACGAATTCATCTGTTTTTTTTTTTTACTCTTCCTAGCTXACATGGC-InverteddT。其中在适配体-1和适配体-2中加粗部分是ATP的两段适配体序列，斜体的部分则是与环形模板的互补序列，3’端修饰的InverteddT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。在线性挂锁探针中的p表示一个5’磷酸基团的修饰，用于在T4DNA连接酶的作用下，与3’端的羟基形成磷酸二酯键，构成环形模板。并且是富含C的序列，使滚环扩增产生富含G的序列形成G-四联体。AP探针中斜体部分表示能与环状模板的结合序列，X表示无嘌呤无嘧啶位点（AP位点），3’端修饰的InverteddT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。本专利技术中ATP的检测是在均相溶液中实现的，通过phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV的配合实现双重信号放大，从而实现ATP的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。均相中发生的反应主要有：环形模板及复合物探针的制备；适配体与目标物ATP的识别过程；滚环扩增及内切酶反馈信号放大反应。（1）环形模板及复合探针的制备。线性挂锁探针与连接探针结合，在T4DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板备用。在含有一段ATP适配体序列的Apt-1能够与制备好的环状模板通过碱基互补配对结合形成复合探针I；而APprobe能够与制备好的环状模板结合形成复合探针II。（2）目标物ATP与两段适配体结合作用。当有目标物存在时，基于邻近分析原理，ATP能够同时与复合探针I和Apt-2结合，产生特定的空间构型。使原本不能杂交的Apt-2与环状模板靠近杂交，同时phi29DNA聚合酶能够水解游离的不匹配碱基，使不成熟引物转化成成熟引物。（3）滚环扩增及内切酶反馈信号放大反应。上述反应产生的RCA前体能够进行滚环扩增反应，产生的RCA产物是富含G的序列能够形成G-四联体，NMM嵌入其中使荧光信号增强。同时复合探针II的3’端能够与RCA产物结合，形成双链。当有核酸内切酶IV存在时，能够切断AP位点释放引物-环状模板结构，在phi29DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性作用下，反馈形成反应第（2）步中相同的引物-环状模板的RCA前体。从而实现多倍数放大循环的反馈滚环扩增。本专利技术的有益效果：1.高特异性检测两段适配体序列与目标物基于邻近分析原理的特异性识别，利用适配体与ATP的绑定作用、phi29DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性实现反馈放大以及核酸内切酶IV的辅助作用实现了对目标物的高特异性检测。2.超灵敏性检测核酸内切酶IV的切割位点（AP位点），实现定位切割，释放转化更多引物进入到新一轮的RCA反应中；RCA产物富含碱基G，能够形成G-四联体，嵌入NMM使其荧光增强；利用phi29DNA聚合酶的聚合作用和3’-5’外切酶活性，在实现滚环扩增放大作用的同时实现反馈再放大以及核酸内切酶放大，实现了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器，其特征在于，包括：两段适配体DNA序列、线性挂锁探针、连接探针、AP探针、T4 DNA连接酶缓冲液、核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ、PBS缓冲液、dNTP、phi29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV；所述的适配体‑1的序列如SEQ No.1所示；所述的适配体‑2的序列如SEQ No.2所示；所述的线性挂锁探针的序列如SEQ No.3所示；所述的连接探针的序列如SEQ No.4所示；所述的AP探针的序列如SEQ No.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测三磷酸腺苷的荧光生物传感器，其特征在于，包括：两段适配体DNA序列、线性挂锁探针、连接探针、AP探针、T4DNA连接酶缓冲液、核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ、PBS缓冲液、dNTP、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV；所述的适配体-1的序列如SEQNo.1所示；所述的适配体-2的序列如SEQNo.2所示；所述的线性挂锁探针的序列如SEQNo.3所示；所述的连接探针的序列如SEQNo.4所示；所述的AP探针的序列如SEQNo.5所示。2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的适配体-1的3’端修饰的反向dT。3.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的线性挂锁探针5’修饰磷酸基团。4.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的AP探针的3’端修饰的反向dT，其中3’端序列第七个碱基上修饰无嘌呤无嘧啶位点。5.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的T4DNA连接酶缓冲液为50mMTris-HCl、10mMMgCl2、10mMDTT和1mMATP；所述的PBS缓冲液为10mMNa2HPO4、10mMNaH2PO4、140mMNaCl、1mMKCl、1mMMgCl2、1mMCaCl2、pH=7.4。6.一种权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建环形模板，制备复合探针；（2）复合探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，王敬锋，王玉，刘素，王海旺，宋晓蕾，张雪，赵一菡，瞿晓南，张儒峰，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37