本发明专利技术公开了一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产克拉酸的方法。所述大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3可用于生产可拉酸，具体方法为：采用埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3作为生产菌种，进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。所述大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3保藏号为：CCTCC 2018200。本发明专利技术第一次通过一株大肠杆菌突变株，在37℃时通过酸诱导发酵生产，不仅产量高，而且细胞生长快，发酵时间短，提供了高效产可拉酸的技术方法。
A Method for Producing Collagic Acid from Acidic Resistant High Density Growing Escherichia coli
The invention discloses a method for producing claric acid by acid-resistant high-density E. coli. The Escherichia coli S17_3 can be used to produce colic acid. The specific method is: Escherichia coli S17_3 of Escherichia is used as a production strain to culture, collect secretions and isolate and obtain colic acid. The storage number of Escherichia coli S17_3 is CCTCC 2018200. The invention first passes through a mutant strain of Escherichia coli and produces by acid-induced fermentation at 37 ~C. It not only has high yield, but also has fast cell growth and short fermentation time, thus providing a technical method for high-efficient production of cola acid.
【技术实现步骤摘要】
一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法。
技术介绍
微生物胞外多糖包括细菌多糖、真菌多糖等，是菌体在生命活动过程中为了适应环境的变化、提高自身生存机率而合成的多糖，都具有各自独特的作用和独特的生物学活性。在细菌生命活动中，它所产生的荚膜多糖或是粘液多糖不仅有保持细胞内外水分平衡、防止细胞失水、保护细胞同时帮助其抵抗有害物质的作用。微生物胞外多糖在工业上也有广泛的应用。如黄原胶、结冷胶和热凝胶等都具有多种重要的生物活性和生理功能，并且由于可以通过发酵大规模生产，因此较植物多糖成本低廉，已在食品、轻工、石油等许多工业领域得到广泛的应用。进一步发展微生物多糖的工业应用，需要加强基础研究，其中包括提高微生物生产胞外多糖的能力研究。可拉酸(colanicacid)是一种以松散形式包裹在大肠杆菌外的一种胞外酸性多糖，是一种M-抗原。可拉酸主要由葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸组成，是一种高分子量的杂多糖，能使菌株表现出菌株粘液化现象，岩藻糖是一种兼具营养学及免疫学研究方面重要的一种糖组份，其提取及生产成本很高，具有很好的应用及工业价值。在逆境环境条件下，粘液化突变菌株较野生菌株有较强的存活力。2017年在杂志cell上首次报道了可拉酸化合物能够明显延长秀丽杆线虫的寿命，很多研究者拭目以待可拉酸在哺乳动物的实验研究。大肠杆菌生产可拉酸的产量很低，在已有的文献报道中，最高产量在1g/l。因此提高微生物发酵生产可拉酸的产量是很重要的科学研究。由于可拉酸导致的菌液粘液化现象，生产可拉酸的大肠杆菌的生长状态不理想，在已有的文献报道中，可拉酸浓度最高时菌株的OD600在5.0左右。因此，生产高密度菌株是提高可拉酸产量的重要限速步骤。在已有的研究结果中，大肠杆菌生产可拉酸的最适温度在20℃左右，且产量低，发酵时间长。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3生产可拉酸的方法。旨在解决现有大肠杆菌种分泌可拉酸效率低的问题。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3。所述大肠杆菌种为实验室保藏的模式大肠杆菌菌种EscherichiacoliS17-1的突变菌株，菌株S17-3已于2018年4月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC2018200。本专利技术分离的埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3，此菌为两端钝圆的短杆菌，大小约0.5–3.0um，具有乳白色且表面光滑的圆形菌落，菌落边缘整齐。经形态学鉴定和16SrDNA序列比对后的发育树分析，确定该菌株为大肠杆菌，按照国际命名规则：属名+种名+株名对该菌株进行命名，属名、种名、株名分别为埃希氏菌属、大肠杆菌种和S17-3，命名为埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3，保藏号为：CCTCC2018200。该菌株具有如下优势：在培养基中补加碳源的条件下，外源表达质粒pBhya-CAB的条件下，菌的密度远远高于其他已有的大肠杆菌，细菌的密度(OD600，600纳米光波时的吸光值)可达到32.0以上，是普通大肠杆菌的最高生长密度的3倍以上。此外，该菌在发酵过程中，各种有机酸等副产物的积累远远低于其他已有的大肠杆菌，使得碳源更多的流向主产物。进一步地，所述大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的16SrDNA核苷酸序列为SEQIDNO.14所示。本专利技术的第二方面他提供了前述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3用于生产可拉酸的用途。所述大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的核苷酸序列为SEQIDNO.14所示。具体的，采用埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3生产可拉酸时，包括步骤：将埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3作为生产菌种，进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。进一步地，将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli用于生产可拉酸。进一步地，将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。所述质粒pBhya-CAB的序列如SEQIDNO.11所示。本专利技术的第三方面提供了一种生产可拉酸的方法，所述方法包括步骤：采用埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3作为生产菌种，进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。所述大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的核苷酸序列为SEQIDNO.14所示。进一步地，所述方法包括步骤：将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli用于生产可拉酸。进一步地，所述方法包括步骤：将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。进一步地，所述质粒pBhya-CAB的序列如SEQIDNO.11所示。进一步地，培养所述大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的培养基为LB培养基或2YT培养基中的任意一种。进一步地，所述培养基中葡萄糖浓度为15-30g/L。经过试验发现，当培养基中的葡萄糖浓度为15-30g/L均可以实现与实施例中所列举的葡萄糖浓度相同的效果。进一步地，所述培养基中抗生素为氨苄青霉素，浓度为20-100ug/mL。进一步地，所述培养基的初始pH为4.5-5.0。进一步地，所述大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3采用摇床培养。更进一步地，所述摇床培养转数为150-300rpm。经过试验发现，当摇床培养转数为150-300rpm均可以实现与实施例中所列举的摇床培养转数相同的效果。进一步地，所述大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3培养的温度为37℃摇瓶培养时不控氧容量，生物反应器控制培养时设置氧容量为30％或以上。进一步地，所述转染可以采用现有技术中的转染方法，例如电转染的方法。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术第一次通过一株大肠杆菌突变株，在37℃时通过酸诱导发酵生产，不仅产量高，而且细胞生长快，发酵时间短，提供了高效产可拉酸的技术方法。本专利技术菌株保藏信息如下：菌株名称：Escherich本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3用于生产可拉酸的用途，所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3保藏号为CCTCC 2018200。
【技术特征摘要】
1.一种埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3用于生产可拉酸的用途，所述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3保藏号为CCTCC2018200。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述EscherichiacoliS17-3的16SrDNA核苷酸序列为SEQIDNO.14所示。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3为两端钝圆的短杆菌，大小0.5–3.0um，具有乳白色且表面光滑的圆形菌落，菌落边缘整齐。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途是指采用埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3生产可拉酸时，包括步骤：将埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3作为生产菌种，进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途是指将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli用于生产可拉酸。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述质粒pBhya-CAB的序列如SEQIDNO.11所示。7.一种生产可拉酸的方法，所述方法至少包括以下...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙俊松，吴海英，纪明华，段海燕，凌喆，史吉平，李久盛，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31
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