利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法技术

利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，涉及一种抗氧化活性物质的生产方法。是要解决现有的微生物发酵产活性物质成分单一的问题。方法：一、将GRP13菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，培养得到活化的GRP13菌株；二、将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基中，培养得到种子培养液；三、取种子液接种至马铃薯液体培养基中发酵，获得GRP13菌株发酵样品，真空抽滤，减压浓缩，即为抗氧化活性物质。本发明专利技术方法能够产生抗氧化活性物质，经检测为多种甘草活性成分，且纯度较高，从而起到节省药用植物甘草资源的目的。本发明专利技术用于微生物发酵产甘草活性物质。

A Method of Producing High-Efficiency Antioxidant Substances by Microbial Fermentation

A method for producing high-efficiency antioxidant substances by microbial fermentation relates to a production method of antioxidant substances. In order to solve the problem of single active ingredient produced by microbial fermentation. Methods: First, GRP13 strain was inoculated on potato solid medium plate, and then the activated GRP13 strain was cultured; second, the activated GRP13 strain was inoculated in liquid potato medium, and the seed culture medium was obtained; third, the seed liquid was inoculated into potato liquid medium for fermentation, and the fermentation sample of GRP13 strain was obtained by vacuum filtration and decompression concentration, that is, antioxidant. Chemoactive substances. The method of the invention can produce antioxidant active substances, which are detected as various active ingredients of licorice and have high purity, thereby saving resources of medicinal plant licorice. The invention is used for producing Glycyrrhiza active substance by microbial fermentation.

【技术实现步骤摘要】
利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法
本专利技术涉及一种抗氧化活性物质的生产方法。
技术介绍
甘草作为一味传统中医药材，主要分布于宁夏、内蒙古、新疆和黑龙江等北部地区，因其具有多种功效，传统配方中又有“十方九草”的说法，故野生甘草被过度采挖，濒临灭绝，现已被列入《野生药材资源保护条例》的国家二级保护植物。经大量研究发现，现有200种物质已经从甘草物种中分离出来，这些物质也会随着甘草种类、地理位置和加工方式的不同而发生明显的改变，其主要成分为：三萜皂苷类、黄酮类物质；其中三萜皂苷类物质主要包括甘草酸、甘草次酸、异甘草次酸，甘草甜素、内脂等；黄酮类物质包含多个种类，如黄烷酮、二氢黄酮、查尔酮和异黄酮等种类，主要代表成分为甘草素(Liquiritigenin)，异甘草素(Isoliquiritigenin)，甘草苷(Liquiritin)，异甘草苷(Isoliquiritin)，新甘草苷(Neoliquiritin)等。目前能够发酵产甘草活性物质的微生物资源较少，而且产生的活性物质均为单一成分，难以代替野生甘草植物。
技术实现思路
本专利技术是要解决现有的微生物发酵产活性物质成分单一的问题，提供一种利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法。本专利技术利用微生物发酵产抗氧化活性物质的方法，包括以下步骤：一、甘草内生真菌GRP13菌株的活化：将GRP13菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于27～29℃恒温箱中，培养3～4d，得到活化的GRP13菌株；二、甘草内生真菌GRP13种子液的制备：将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基中，于27～29℃，130～150r/min摇床培养3～4d，制成1×107～1×108CFU/mL种子培养液；三、甘草内生真菌GRP13发酵液供试品的制备：取种子液接种至马铃薯液体培养基中，27～29℃、130～150r/min摇床发酵14～16d，获得GRP13菌株发酵样品，将GRP13菌株发酵样品真空抽滤，得GRP13菌株发酵液，将所得GRP13菌株发酵液至于50～55℃减压浓缩至相对密度为1.1～1.2，即为抗氧化活性物质。所述GRP13菌株为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)GRP13，已在中文专利CN104774774B中公开，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCCNO：M2015186。进一步的，步骤一中马铃薯固体培养基的配方为去皮马铃薯块200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。进一步的，步骤二中液体马铃薯培养基的配方为去皮马铃薯块200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。马铃薯培养基的配置方法为：取200g马铃薯块煎汁30，过滤，加入20g葡萄糖，定容至1L，pH值7.0，121℃灭菌30min，冷却，备用。进一步的，步骤二中将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基的接种量是3％～7％。进一步的，步骤三中种子液接种至马铃薯液体培养基中的接种量是3％～7％。本专利技术的有益效果：本方法发酵获得的发酵物经过检测，具有较高的抗氧化活性，其DPPH自由基清除能力与维生素C相当。取甘草内生真菌GRP13发酵液供试品，先采用水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液；再采用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；最后采用乙醚萃取3次，合并萃取液；50～55℃减压浓缩后，分别得到GRP13菌株发酵液水饱和正丁醇萃取部位A、乙酸乙酯萃取部位B和乙醚萃取部位C。甘草内生真菌GRP13发酵液各有效部位对DPPH自由基均具有一定的清除作用，清除作用为：乙醚部位C>乙酸乙酯部位B>水饱和正丁醇部位A。进一步对甘草内生真菌GRP13发酵液中活性成分进行分离，确定其中包含4种化合物，分别为苯甲酸、甘草次酸、甘草素、甘草苷，其中有三种为甘草活性成分，更接近于甘草中的实际活性成分。且所分离得到的4种活性成分均具有较好的纯度，纯度分别为97％、96.3％、96％、95.7％。本专利技术方法能够产生抗氧化活性物质，经检测为多种甘草活性成分，且纯度较好，从而起到节省药用植物甘草资源的目的，且工艺简单，成本低，使用生物发酵来生产，不污染环境。附图说明图1为甘草内生真菌GRP13发酵液及各有效部分的抗氧化活性测试结果；图2为实施例1中化合物A的HPLC图谱；图3为实施例1中化合物B的HPLC图谱；图4为实施例1中化合物C的HPLC图谱；图5为实施例1中化合物D的HPLC图谱。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式利用微生物发酵产抗氧化活性物质的方法，包括以下步骤：一、甘草内生真菌GRP13菌株的活化：将GRP13菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于27～29℃恒温箱中，培养3～4d，得到活化的GRP13菌株；二、甘草内生真菌GRP13种子液的制备：将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基中，于27～29℃，130～150r/min摇床培养3～4d，制成1×107～1×108CFU/mL种子培养液；三、甘草内生真菌GRP13发酵液供试品的制备：取种子液接种至马铃薯液体培养基中，27～29℃、130～150r/min摇床发酵14～16d，获得GRP13菌株发酵样品，将GRP13菌株发酵样品真空抽滤，得GRP13菌株发酵液，将所得GRP13菌株发酵液至于50～55℃减压浓缩至相对密度为1.1～1.2，即为抗氧化活性物质。所述GRP13菌株为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)GRP13，已在中文专利CN104774774B中公开，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月1日，保藏编号为CCTCCNO：M2015186。本方法发酵获得的发酵物经过检测，具有较高的抗氧化活性，其DPPH自由基清除能力与维生素C相当。取甘草内生真菌GRP13发酵液供试品，先采用水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液；再采用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；最后采用乙醚萃取3次，合并萃取液；各萃取液于50～55℃减压浓缩后，分别得到GRP13菌株发酵液水饱和正丁醇萃取部位A、乙酸乙酯萃取部位B和乙醚萃取部位C。甘草内生真菌GRP13发酵液各有效部位对DPPH自由基均具有一定的清除作用，清除作用为：乙醚部位C>乙酸乙酯部位B>水饱和正丁醇部位A。进一步对甘草内生真菌GRP13发酵液中活性成分进行分离，确定其中包含4种化合物，分别为苯甲酸、甘草次酸、甘草素、甘草苷，其中有三种为甘草活性成分，更接近于甘草中的实际活性成分。且所分离得到的4种活性成分均具有较好的纯度，纯度分别为97％、96.3％、96％、95.7％。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中马铃薯固体培养基的配方为去皮马铃薯块200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中液体马铃薯培养基的配方为去皮马铃薯块200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。其它与具体实施方式一或二相同。具体实施方式四：本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：一、甘草内生真菌GRP13菌株的活化：将GRP13菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于27～29℃恒温箱中，培养3～4d，得到活化的GRP13菌株；二、甘草内生真菌GRP13种子液的制备：将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基中，于27～29℃，130～150r/min摇床培养3～4d，制成1×107～1×108CFU/mL种子培养液；三、甘草内生真菌GRP13发酵液供试品的制备：取种子液接种至马铃薯液体培养基中，27～29℃、130～150r/min摇床发酵14～16d，获得GRP13菌株发酵样品，将GRP13菌株发酵样品真空抽滤，得GRP13菌株发酵液，将所得GRP13菌株发酵液至于50～55℃减压浓缩至相对密度为1.1～1.2，即为抗氧化活性物质。

【技术特征摘要】
1.利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：一、甘草内生真菌GRP13菌株的活化：将GRP13菌株接种于马铃薯固体培养基平板上，放置于27～29℃恒温箱中，培养3～4d，得到活化的GRP13菌株；二、甘草内生真菌GRP13种子液的制备：将活化后的GRP13菌株接种于液体马铃薯培养基中，于27～29℃，130～150r/min摇床培养3～4d，制成1×107～1×108CFU/mL种子培养液；三、甘草内生真菌GRP13发酵液供试品的制备：取种子液接种至马铃薯液体培养基中，27～29℃、130～150r/min摇床发酵14～16d，获得GRP13菌株发酵样品，将GRP13菌株发酵样品真空抽滤，得GRP13菌株发酵液，将所得GRP13菌株发酵液至于50～55℃减压浓缩至相对密度为1.1～1.2，即为抗氧化活性物质。2.根据权利要求1所述的利用微生物发酵产高效抗氧化活性物质的方法，其特征在于：步骤一中马铃薯...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑春英，张萍，王宇晴，姜硕，许哲祥，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23