一种烟草氯离子吸收基因NtSLAC2及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种烟草氯离子吸收基因NtSLAC2及其克隆方法与应用，烟草氯离子吸收基因NtSLAC2核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明专利技术还公开了烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的克隆方法，具体步骤包括：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；以反转录得到的第一链cDNA作为模板，根据NtSLAC2基因序列设计合成特异性引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。本发明专利技术中，在烟草植株内抑制烟草内源基因NtSLAC2的表达，会使烟草烟叶的氯离子含量明显降低，在植物低氯离子含量育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

Cloning and Application of a Chloride Absorption Gene NtSLAC2 from Tobacco

The invention discloses a tobacco chloride ion absorption gene NtSLAC2 and its cloning method and application. The nucleotide sequence of the tobacco chloride ion absorption gene NtSLAC2 is shown in SEQ ID:No.1 and the encoded amino acid sequence is shown in SEQ ID:No.2. The invention also discloses the cloning method of the chloride ion absorption gene NtSLAC2 in tobacco. The specific steps include: extracting tobacco RNA and retranscribing to obtain the first chain of DNA; using the first chain of DNA retranscribed as template, designing and synthesizing specific primers according to the sequence of NtSLAC2 gene, carrying out PCR amplification, recovering and purifying the amplified products of PCR, and sequencing. In the present invention, inhibiting the expression of the endogenous gene NtSLAC2 in tobacco plants can significantly reduce the chloride ion content of tobacco leaves, which has broad application prospects in the field of plant breeding with low chloride ion content, and has great economic benefit potential.

【技术实现步骤摘要】
一种烟草氯离子吸收基因NtSLAC2及其克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的克隆方法与应用。
技术介绍
氯离子含量是烟草中重要的质量参数，烟叶中的氯离子含量以0.3~0.8作为合适，如果烟叶中氯离子含量过高，会影响卷烟制品的燃烧性，会造成卷烟制品的阴燃，从而会使卷烟制品的烟气中具有更多的一氧化碳及焦油，这样会危害消费者的健康。并且当氯离子含量更高的时候，会直接造成熄火的现象。目前我国在种植蔬菜和粮食作物的时候，会使用大量的化肥农药，现在的化肥中含量大量的氯离子，而这些含有氯离子的化肥在使用的过程中会造成耕作土壤中氯离子含量的超标。而土壤氯离子含量的超标会造成栽培作物过量的吸收氯离子从而造成作物体内的氯离子含量超标，这样会影响农作物的品质。为解决烟叶氯离子含量偏高的问题，采用低氯含量化肥是最直接的手段，但是考虑到低氯含量化肥的生产成本要显著的高于高氯含量化肥，因此化肥生产厂家与农民考虑到成本的因素，往往不会使用低氯化肥而使用高氯离子含量的化肥。另外现在中国的耕作土壤中氯离子含量超标已经较为严重，即便现在开始使用低氯离子含量的化肥也不能很快的解决作物尤其是烟草中氯离子超标的问题。因此传统的农艺措施很难改变目前烟叶中氯离子超标的问题。随着分子生物学技术的发展，采用分子手段去除烟草中特定的吸收氯离子的通道是解决这一问题的一种手段。目前的研究表明慢阴离子通道（SLAC）蛋白家族主要在植物阴离子（氯离子和硝酸根离子等）摄取和气孔开闭过程中起到重要作用。目前已有在本氏烟中通过瞬时转化的方法（VIGS）来验证其基因家族中一个基因的功能。但因为SLAC基因是一个基因家族，会存在基因分化的可能，同时本氏烟中基因与栽培烟存在较大的差异，因此通过RNAi干扰的手段在栽培烟草中直接验证栽培基因中内源SLAC基因功能是确定负责栽培烟草中氯离子吸收基因的关键。通过确定栽培烟草中氯离子吸收的关键基因是培育低氯离子含量烟草的基础，因此本专利技术具有较大的经济价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种烟草氯离子吸收基因NtSLAC2；第二目的在于提供所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。本专利技术的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；B、NtSLAC2基因的PCR扩增：以反转录得到的第一链cDNA作为模板，根据NtSLAC2基因序列设计合成特异性引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。本专利技术的第三目的是这样实现的，所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2在获得低氯转基因植株中的应用。本专利技术所述烟草氯离子吸收基因NtSLAC2包含的核苷酸序列如SEQID：No.1所示。或者在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本专利技术所述烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的应用为在烟草植株体内抑制所述NtSLAC2基因的表达，可降低烟草中氯离子的含量。可通过由RNA介导的多种方法抑制NtSLAC2基因的表达，如：植物病毒载体介导基因沉默的方法、农杆菌介导转化RNAi干扰载体、优化修改基因编码区、优化基因启动子等方法。本专利技术所述的抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制NtSLAC2表达即可。携带有本专利技术NtSLAC2基因的RNAi载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。本专利技术的烟草氯离子吸收蛋白及其编码基因为农作物尤其是烟草低氯离子含量品种育种提供基因与技术的支持。本专利技术中，在烟草植株内抑制烟草内源基因NtSLAC2的表达，会使烟草烟叶的氯离子含量明显降低，在植物低氯离子含量育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。附图说明图1为NtSLAC2基因的PCR产物电泳图；其中，M-分子量标记；1-PCR产物；图2为中间载体Pdonr-zeo图；图3为NtSLAC2基因植物RNAi干扰载体pHellsgate12图；图4为转NtSLAC2基因RNAi干扰载体的烟草株系基因表达水平柱状图；图5为NtSLAC2基因RNAi干扰烟草植株的氯离子含量示意图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的克隆方法，包括以下步骤：A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；B、NtSLAC2基因的PCR扩增：以反转录得到的第一链cDNA作为模板，根据NtSLAC2基因序列设计合成特异性引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。C步骤中所述的特异性引物为：正向引物：5’-ATGAGAATCACTCCTGCATTAGATG-3’；反向引物：5’-TCAAATAATTCGAGAAGACTGTTTG-3’；所述的PCR扩增的反应体系和反应条件如下：。本专利技术所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的应用为所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2在获得低氯转基因植株中的应用。下面以具体实施案例对本专利技术进行进一步说明：实施例1克隆NtSLAC2基因以烟草叶片cDNA为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行NtSLAC2基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物，设计引物如下所示：正向引物：5’-ATGAGAATCACTCCTGCATTAGATG-3’；反向引物：5’-TCAAATAATTCGAGAAGACTGTTTG-3’；PCR反应体系和扩增条件如下所示：将扩增获得的PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图1所示，电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送Invitrogen测序，验证序列结果。实施例2植物RNAi载体的构建以实施例1中NtSLAC2全长片段为模板，用含有gateway接头序列的引物进行PCR扩增，扩增产物经PCR产物纯化后，经过BP反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体（见图2）中，将构建好的BP反应载体通过LR反应将NtSLAC2片段置换到PHellsgate12RNAi干扰载体（见图3）中。（1）gateway反应引物序列如下：NtSLAC2_F5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCTTTACTAAGGGGAAGAGACTTTTAACA-3’；NtSLAC2_R5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草氯离子吸收基因NtSLAC2，其特征在于所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种烟草氯离子吸收基因NtSLAC2，其特征在于所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2，其特征在于所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种权利要求1或2所述的烟草氯离子吸收基因NtSLAC2的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；B、NtSLAC2基因的PCR扩增：以反转录得到的第一链cDNA作为模板，根据NtSLAC2基因序列设计合成特异性引物，进行P...

【专利技术属性】
技术研发人员：白戈，谢贺，逄涛，杨大海，李勇，姚恒，童治军，张谊寒，肖炳光，李永平，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53