本发明专利技术提供一个来自于蒌叶假单胞菌Pseudomonas beteli的苹果酸脱氢酶PbMDH，该苹果酸脱氢酶的编码基因及其应用。本发明专利技术提供的带有苹果酸脱氢酶PbMDH核苷酸序列的克隆质粒可以通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节所述编码基因的表达，能够高效表达苹果酸脱氢酶PbMDH，为苹果酸脱氢酶的生产提供有效途径。本发明专利技术提供的海洋来源的苹果酸脱氢酶具有耐盐耐高温的性能，具有重要的工业化应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码序列和应用
本专利技术涉及基因工程和酶工程
，涉及一种苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码序列和应用，具体涉及一种海洋来源的蒌叶假单胞菌(Pseudomonasbeteli)的苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码基因和应用。
技术介绍
苹果酸脱氢酶(EC:1.1.1.37)在动物、植物和各种生物体内广泛存在，具有高度的保守性，能够催化苹果酸和草酰胺乙酸的相互转化，在包括三羧酸循环、C4循环、氨基酸合成等的代谢中起着重要的作用。苹果酸脱氢酶的分类有不同的方法。根据其在真核细胞中分布不同而分类，苹果酸脱氢酶主要可分为细胞质苹果酸脱氢酶、线粒体苹果酸脱氢酶和叶绿体苹果酸脱氢酶，它们分别存在于细胞质、线粒体和叶绿体中，另外，亚细胞定位，发现苹果酸脱氢酶也存在于乙醛酸体以及锥虫甘油体内。苹果酸脱氢酶PbMDH在临床医药和农业生产等领域，都具有非常重要的应用。在临床中，苹果酸脱氢酶活性异常增高，有可能是由于心机梗死、溶血性疾病、巨幼红细胞贫血、镰刀型红细胞贫血、急性肝病、癌转移等疾病，因此苹果酸脱氢酶可作为临床诊断试剂盒的用途。在农业生产领域中，某些地区的土壤中含有超量的金属离子，这会对植物产生一定的毒害作用，而苹果酸脱氢酶PbMDH能够催化草酰乙酸得到苹果酸，从而跟金属离子共价结合，降低其对农作物的毒害作用，有利于农作物增产和促进农业的大规模发展。1981年，Tanaka团队从极端嗜热菌ThermusthermophilusHB8中克隆到了一个3-异丙基苹果酸脱氢酶。2006年，福州大学汪少芸等人首次发现了豆科植物来源的苹果酸脱氢酶，发现钾离子能够提高苹果酸脱氢酶酶活性，锌离子、铅离子和铜离子会降低酶活性。2007年，江南大学龚韧等人从猪心肌中克隆表达了苹果酸脱氢酶，并研究了其酶学性质，该酶的最适温度为50℃。2011年，江南大学李倩团队以大肠杆菌基因组为模板，克隆得到苹果酸脱氢酶，并构建了重组菌成功表达了目的苹果酸脱氢酶，该酶的最适温度为37℃。2013年，西南大学孙芳等人分离纯化了鸭心来源的苹果酸脱氢酶，其最适温度为55℃。当苹果酸脱氢酶处于温度比较极端的环境下，大多数种属的的酶活力会有比较显著的下降。苹果酸脱氢酶的应用也很广泛，在食品工业苹果酸脱氢酶用于L-苹果酸、柠檬酸等有机酸的检测；在临床上苹果酸脱氢酶用于肝炎、DIC等疾病的早期诊断。总之，苹果酸脱氢酶是生物体内的关键酶，国内外学者都对其进行着跟踪研究，并且具有广泛的应用。目前海洋来源的苹果酸脱氢酶的挖掘并未多见。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种苹果酸脱氢酶PbMDH及其编码序列和应用，所述苹果酸脱氢酶PbMDH具有耐盐性耐高温，具有良好的工业生产前景。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种苹果酸脱氢酶PbMDH，其具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：(I)具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(II)与SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；(III)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；其中，所述氨基酸序列具有苹果酸脱氢酶的活性。本专利技术中，专利技术人通过大量的实验对海洋来源的苹果酸脱氢酶进行研究，发现其中来源于蒌叶假单胞菌的苹果酸脱氢酶比酶活高，耐盐性耐高温，有利于工业氧化还原，所述SEQIDNO.1所示的氨基酸序列如下：MSDFKTAALDYHSQPRPGKLSVELTKPTATARDLSLAYSPGVAAPVREIARDAELAYRYTGKGNLVAVISDGTAILGLGNLGPLASKPVMEGKGVLFKRFAGVDVFDIEVDAESPQAFIDTVKRISITFGGINLEDIKAPECFEIERALIEQCDIPVFHDDQHGTAIVTAAGMLNALEIAGKSIEDAKIVCLGAGAAATSCMKLLVSIGAKIENIFMIDRKGVIHAGRDDLNQYKAIFAHETDKRTLDDALDGADVFVGLSGANLLSPEGLKRMAANPIVFACSNPDPEISPELAHATRSDVIMATGRSDYPNQVNNVLGFPFIFRGALDVRAKRINEEMKIAAALALRDLAKLPVPAEVCEAYGGQSLEFGREYIIPKPMDPRLITLVSDAVAKAAIESGVATLPYPANYPLKSVDDVFNG.在本专利技术的一些实施例中，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，且具有苹果酸脱氢酶的活性。在本专利技术的一些实施例中，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少92％同一性的序列，且具有苹果酸脱氢酶的活性。在本专利技术的一些实施例中，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，且具有苹果酸脱氢酶的活性。在本专利技术的一些实施例中，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的序列，且具有苹果酸脱氢酶的活性。在本专利技术的一些实施例中，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的序列，且具有苹果酸脱氢酶的活性。根据本专利技术，所述苹果酸脱氢酶的来源为海洋来源，优选为海洋来源的蒌叶假单胞菌，其中所述蒌叶假单胞菌(Pseudomonasbeteli)。第二方面，本专利技术提供一种核苷酸，具有(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列中的任意一个：(I)编码如第一方面所述的苹果酸脱氢酶PbMDH的核苷酸序列；(II)具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；(III)与SEQIDNO.2所示核苷酸序列具有≥85％，优选≥90％，更优选≥92％，最优选≥95％同源性的核苷酸序列。所述SEQIDNO.2所示的核苷酸序列如下：ATGTCAGATTTTAAAACTGCTGCTCTTGACTACCATTCCCAGCCGCGTCCGGGAAAGCTGAGCGTAGAGTTGACCAAGCCTACTGCCACCGCTCGTGATCTGTCGTTGGCCTACAGTCCAGGCGTTGCCGCACCCGTTCGTGAGATCGCTCGTGATGCCGAGCTGGCCTACCGCTACACCGGTAAGGGCAACCTGGTGGCGGTCATCTCCGACGGCACCGCAATTCTGGGGCTGGGTAACCTGGGGCCGCTGGCGTCCAAGCCGGTAATGGAAGGCAAGGGCGTTCTGTTCAAGCGCTTCGCTGGCGTGGACGTGTCGATATCGAAGTCGATGCCGAAAGCCCGCAGGCTTTCATCGATACCGTCAAGCGCATCTCCATTACCTTCGGCGGCATCAACCTCGAAGACATCAAGGCGCCCGAGTGCTTCGAGATCGAGCGCGCGCTCATCGAGCAGTGCGATATCCCGGTCTTCCATGACGACCAGCACGGCACTGCGATCGTTACCGCGGCCGGCA本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种苹果酸脱氢酶PbMDH，其特征在于，其具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：(I)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；(III)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；其中，所述氨基酸序列具有苹果酸脱氢酶的活性。
【技术特征摘要】
1.一种苹果酸脱氢酶PbMDH，其特征在于，其具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：(I)具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(II)与SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；(III)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；其中，所述氨基酸序列具有苹果酸脱氢酶的活性。2.根据权利要求1所述的苹果酸脱氢酶PbMDH，其特征在于，所述苹果酸脱氢酶的来源为海洋来源，优选为海洋来源的蒌叶假单胞菌。3.一种核苷酸，其特征在于，具有(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列中的任意一个：(I)编码如权利要求1或2所述的苹果酸脱氢酶PbMDH的核苷酸序列；(II)具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；(III)与SEQIDNO.2所示核苷酸序列具有≥85％，优选≥90％，更优选≥92％，最优选≥95％同源性的核苷酸序列。4.一种载体，其特征在于，所述载体含有至少一个拷贝的如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：方柏山，王雅丽，张永辉，苏洁茹，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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