用于检测髓过氧化物酶活性荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于分析化学技术领域，具体为用于检测髓过氧化物酶活性的荧光探针及其制备方法和应用。本发明专利技术的荧光探针化合物通过对次氯酸响应产生荧光检测髓过氧化物酶的活性，对其它常见的活性氧/活性氮不响应。其优点在于对次氯酸具有较高的选择性和灵敏度，且响应迅速快，不需要复杂的仪器，对髓过氧化物酶活性的检测限低，可以检测活体层次的髓过氧化物酶的活性。该类化合物可作为荧光探针应用于疾病预诊断及荧光成像等领域。

【技术实现步骤摘要】
用于检测髓过氧化物酶活性荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一类可用于检测髓过氧化物酶(MPO)活性的荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是一类以亚铁血红素作为辅因子的过氧化物酶，几乎专一性地存在于骨髓细胞、两种血液白细胞(中性粒细胞和单核细胞)以及病理状态下的巨噬细胞中。MPO能够催化过氧化氢(H2O2)和氯离子(Cl-)反应产生HOCl，目前MPO是已知唯一能在生理条件下催化生成次氯酸(HOCl)的酶。除了HOCl，MPO也可以催化产生其他活性氧/活性氮(ROS/RNS)，如酪氨酰自由基和羟基自由基(·OH)。MPO异常表达产生过量的ROS/RNS能够直接氧化DNA、蛋白质和脂质等生物大分子引起细胞死亡和组织损伤。许多研究表明这与许多疾病的发病机制有关，如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、帕金森病和某些癌症，并且已经确定MPO是预测和诊断心脑血管疾病的生物标志物之一。因此，检测生物体内MPO活性对于理解MPO的病理作用并且对疾病的早期诊断和治疗具有十分重要的意义。目前，用于直接检测MPO活性的方法不是很多，在临床上常用的是酶联免疫吸附法(ELISA)，其测试原理基于抗原与抗体之间的特异性结合反应，对MPO进行定量检测。尽管ELISA方法高灵敏度，高选择性和重复性好，但是耗时长、成本高等缺点限制了其广泛应用。由于荧光探针具有选择性和灵敏度高、响应时间快以及检测所需的仪器相对简单等优势已经引起了人们越来越多的关注。基于生物体内MPO是唯一可以催化产生HOCl的酶，我们开发了一种基于HOCl响应的荧光探针，实现了对活体内MPO活性的检测。与商用ELISA试剂盒对比，本方法可以大大节省检测时间并且降低成本，有利于MPO相关疾病的早期诊断，因此开发这类荧光探针具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的用于检测髓过氧化物酶的荧光探针及其制备方法和应用。本专利技术提供的用于检测髓过氧化物酶的荧光探针，为具有式Ι所示结构的化合物：。其中：（1）Z为O或S；（2）R1、R4、R5、R6、R7和R10可以各自独立地选自氢原子、卤素或烷基；（3）R2、R3、R8和R9可以各自独立地选自氢原子、未取代的烷基、苯基取代的烷基、烷氧基或羟烷氧基；（4）本专利技术中所述的烷基是指饱和的烷烃，包括直链或具有支链的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基和叔丁基。本专利技术提供的荧光探针的制备方法，其反应路线如下：。具体步骤如下：（1）中间体B的制备将化合物A和碱混合后，滴加还原剂，得到中间体B，不需分离，可直接进入下一步反应；所述的碱选自各种有机碱和无机碱，优选碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯。所述的还原剂选自连二亚硫酸钠、维生素C、硫酸亚铁铵，优选连二亚硫酸钠。溶剂优选二氯甲烷和水的混合体系，反应温度20-80℃，优选40℃；（2）荧光探针I的制备向含有化合物B的反应体系中加入三光气，制备中间体C，中间体C可以不经纯化，直接用于下步反应；将碱、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和氨水或者取代的氨基衍生物溶于溶剂中，滴加化合物C，反应得到化合物I。本专利技术中，所述的碱选自各种有机碱和无机碱，优选碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯。溶剂优选二氯甲烷，反应温度-10-20℃，优选0℃。本专利技术中，具有式Ι结构化合物与次氯酸具有如下所示的响应机理：。本专利技术的荧光探针（既具有式Ι结构的化合物）本身没有荧光，与次氯酸响应后会先生成中间体B，然后再进一步被次氯酸氧化生成具有强荧光发射的化合物A。本专利技术所述荧光探针，可用于检测MPO活性（在溶液以及动物活体层次）。具体步骤如下：（1）将荧光探针溶解于有机溶剂中，配制成1mM母液，然后稀释到PBS缓冲溶剂(10mM,pH=7.2)中配制成5μM溶液，与次氯酸响应后，用于检测MPO活性；（2）将荧光探针溶解于有机溶剂中，配制成1mM母液，然后注射100μL到动物的炎症模型中，用于活体层次检测MPO活性。这里，有机溶剂为甲醇、乙醇或N,N-二甲基甲酰胺等。本专利技术的效果表现在：（1）荧光探针对次氯酸响应非常迅速（＜10s），且检测MPO活性的检测限低（LOD=4.2mU/mL）；（2）荧光探针对次氯酸有优异的选择性，对其它常见的活性氧/活性氮不响应；（3）荧光探针可应用在活体层次，基于对次氯酸响应检测老鼠关节炎模型中MPO活性。附图说明图1为本专利技术涉及的实施例1所述的荧光探针FD-301的1HNMR谱图（400MHz,DMSO-d6）。图2为本专利技术涉及的实施例1所述的荧光探针FD-301的13CNMR谱图（100MHz,DMSO-d6）。图3为本专利技术涉及的实施例1所述的荧光探针FD-301与次氯酸响应前后的荧光谱图。FD-301的浓度为5μM，次氯酸的浓度为15μM激发波长为620nm。图4为本专利技术涉及的荧光探针FD-301与次氯酸响应的时间依赖图。图5为本专利技术涉及的实施例1所述的荧光探针FD-301的选择性荧光谱图。FD-301的浓度为5μM，ROS/RNS和次氯酸采用图中所示的不同浓度。比较的ROS/RNS从A到J分别为：t-BuOO•,KO2,NO,•OH,ONOO-,ROO•,H2O2,t-BuOOH,HOCl。比较的为686nm发射处的荧光强度，激发波长为620nm。图6为本专利技术涉及的荧光探针FD-301与不同浓度MPO（0、1、10、50、100和500mU/mL）响应的荧光谱图。FD-301的浓度为5μM，H2O2的浓度为10μM，激发波长为620nm。图7为本专利技术涉及的荧光探针FD-301检测MPO活性的标准曲线。FD-301的浓度为5μM，H2O2的浓度为10μΜ，标准曲线MPO浓度分别为10、20、30、40和50mU/mL，激发波长为620nm。图8为本专利技术涉及的荧光探针FD-301在小鼠关节炎模型中的荧光成像图。图9为本专利技术涉及的实施例2所述的荧光探针FD-302的1HNMR谱图（400MHz,DMSO-d6）。图10为本专利技术涉及的实施例2所述的荧光探针FD-302与次氯酸响应前后的荧光谱图。FD-302的浓度为5μM，次氯酸的浓度为15μM激发波长为620nm。图11为本专利技术涉及的实施例2所述的荧光探针FD-302与不同浓度MPO（0和50mU/mL）响应的荧光谱图。FD-302的浓度为5μM，H2O2的浓度为10μM，激发波长为620nm。具体实施方式实施例1具有式Ι结构的化合物FD-301的制备以及检测MPO活性的性能：。（1）化合物FD-301的制备在三颈烧瓶中加入亚甲基蓝（2.0g,6.25mmol）用15mL二氯甲烷和40mL水溶解。向体系中加入碳酸钠（2.65g,25.00mmol）将体系置于40℃下搅拌，氮气保护后向体系中滴加用20mL水溶解的连二亚硫酸钠（3.26g,18.75mmol）。加完后反应20min，此时体系发生明显的分层，下层为黄色溶液。将体系静置，然后向体系中滴加10mL二氯甲烷溶解的三光气（0.93g,3.13mmol），滴完后转移至室温下搅拌反应1h。将体系静置，分层后用注射器吸出下层清夜，滴入混有4-氨基苯甲酸酰肼（181.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测髓过氧化物酶活性的荧光探针，为具有式Ι所示结构的化合物：

【技术特征摘要】
1.一种用于检测髓过氧化物酶活性的荧光探针，为具有式Ι所示结构的化合物：其中：Z为O或S；R1、R4、R5、R6、R7和R10分别选自氢原子、卤素或烷基；R2、R3、R8和R9分别选自氢原子、未取代的烷基、苯基取代的烷基、烷氧基或羟烷氧基；所述的烷基是指饱和的烷烃，选自直链或具有支链的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基和叔丁基。2.一种如权利要求1所述的用于检测髓过氧化物酶活性的荧光探针的制备方法，其特征在于，合成路线如下：具体步骤为：（1）中间体B的制备将化合物A和碱混合，然后滴加还原剂，得到中间体B；所述的碱选自有机碱和无机碱，所述的还原剂选自连二亚硫酸钠、维生素C、硫酸亚铁铵，溶剂选自二氯甲烷和水的混合体系，反应温度20-80℃；（...

【专利技术属性】
技术研发人员：易涛，刘玲燕，魏鹏，刘中宽，李若涵，曹春艳，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31