BRAF基因V600E突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品技术

本发明专利技术涉及一种BRAF基因V600E突变数字PCR检测体系的优化方法，检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板；野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，突变型模板是酶切后的插入BRAF基因V600E突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按一定的拷贝数比例配制成标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域。采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，确定背景阈值。通过本发明专利技术的BRAF基因V600E突变数字PCR检测体系的优化方法优化后的检测产品准确度更高。

Optimizing Method and Products of Detection System of BRAF Gene V600E Mutation by Digital Polymerase Chain Reaction

The invention relates to an optimization method of a digital PCR detection system for BRAF gene V600E mutation, which includes upstream primers, downstream primers, wild-type probes, mutant probes, wild-type templates and mutant templates; wild-type templates are normal human gDNA after enzymatic digestion, and mutant templates are mutant plasmids inserted into the V600E mutant fragment of BRAF gene after enzymatic digestion; mutant templates are transformed into mutant templates. The standard products were prepared with wild-type template according to a certain proportion of copies. The fluorescent regions of wild-type and mutant were selected by using digital PCR to react with medium mutation frequency standard products as templates and making statistical data maps based on reaction data. The background thresholds were determined by using the wild-type template as the template for digital PCR. The optimized method of the BRAF gene V600E mutation digital PCR detection system has higher detection accuracy.

【技术实现步骤摘要】
BRAF基因V600E突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品
本专利技术涉及检测人类BRAF基因V600E突变的数字PCR检测产品及其优化方法，属于生物

技术介绍
BRAF基因属于RAF基因家族的一员，是RAS通路的下游基因，该基因家族有还有另外两个基因：ARAF、CRAF。BRAF基因位于7q34染色体，长度约为190kb，由18个外显子组成。BRAF基因在Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路中发挥重要作用，其编码蛋白有CR1、CR2、CR3三个保守区域，其中CR1、CR2具有调节催化活性的功能，CR3为激酶区域，为ATP激活区和结合位点。BRAF基因通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶来发挥作用，将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK与ERK得以与细胞核内的转录因子连接，促使多种因子参与到调节细胞的生长、分化以及凋亡等过程中。RAF基因家族中，BRAF基因发生突变频率最高，人类癌症中约有8％发生了BRAF突变。BRAF基因突变的类型超过了45种，主要突变位置位于该基因的蛋白酶激活区域，BRAF基因15号外显子的第1799核苷酸T-A的突变最为常见，可使其编码的蛋白质发生V600E的突变，该突变站BRAF突变的90％以上。在癌细胞中，BRAF基因发生V600E突变，使MEK-ERK通路持续激活，促使细胞持续增值，抑制细胞凋亡，进而导致肿瘤细胞的持续发展。因为BRAF基因位于级联信号传导途径的下游，BRAF基因突变与表皮生长因子受体抑制剂的药效有关。西妥昔昔单抗和帕尼单抗作用于肿瘤细胞的表面的表皮生长因子受体，从而抑制肿瘤细胞的增殖。无BRAF基因突变的患者可从西妥昔昔单抗和帕尼单抗等靶向单抗药物治疗中获益，而对于BRAF存在突变的患者则无疗效。因此，在使用此类抗肿瘤药物时，对BRAF基因V600E突变进行检测成为一种需要。传统的针对对基因特定位点的突变检测常用的方法有一代测序和qPCR，但其灵敏度较低，因此需要具备高突变比例的组织标本进行检测，不适合实时检测监控。血浆游离DNA(cfDNA)是存在于血浆中的一种小片段DNA，平均长度在180bp，由体细胞产生释放进入血液。ctDNA是由肿瘤细胞释放进入血液的片段化DNA，因此，可通过检测ctDNA中的突变信息反应肿瘤细胞的突变信息。对cfDNA中的ctDNA的检测成为检测肿瘤突变的一种途径。cfDNA用于肿瘤突变检测优势在于操作无创，可实现实时检测和动态监测，克服肿瘤组织的异质性。然而，ctDNA所占cfDNA的含量极低，低于百分之一，传统检测方法无灵敏且准确的检测出血浆游离DNA中所包含突变信息。数字PCR(dPCR)的出现革新了传统PCR检测的发展，极大的提高了检测的灵敏度。通过统计大量的单拷贝反应微滴，大大的提高了准确度和精密度。由于dPCR统计的是单个分子总数，理论上能做到每个反应单位为单拷贝模板。因此，数字PCR可以达到绝对定量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以使得数字PCR反应体系检测的准确度有更高的BRAF基因V600E突变数字PCR检测体系的优化方法，以及通过该优化方法优化后的检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种BRAF基因V600E突变数字PCR检测体系的优化方法，所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，所述突变型模板是酶切后的插入BRAF基因V600E突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同；采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品，采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应，根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系，优化野生型探针和突变型探针的使用浓度。所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大，且反应终点荧光值与初始荧光值的差值越大，则野生型探针和突变型探针的使用浓度越好。将突变型模板和野生型模板按1:1000至1:10000的拷贝数比例配制成低突变频率标准品，采用数字PCR以低突变频率标准品为模板进行反应，若突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数大于所述背景阈值的2.5倍，则该检测体系的灵敏度达到低突变频率标准品的拷贝数比例相同的值。所述野生型探针和突变型探针是MGB探针，所述野生型探针和突变型探针的3’端均为NFQ基团。所述野生型探针的5’端为VIC基团，所述突变型探针的5’端为FAM基团。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：采用上述的优化方法优化后的BRAF基因V600E突变数字PCR检测产品。所述上游引物和下游引物在反应体系中的终浓度为900nM，所述野生型探针和突变型探针在反应体系中的终浓度为200nM。所述野生型探针和突变型探针是MGB探针，所述野生型探针和突变型探针的3’端均为NFQ基团；所述野生型探针的5’端为VIC基团，所述突变型探针的5’端为FAM基团。本专利技术具有积极的效果：(1)本专利技术的BRAF基因V600E突变检测体系，采用的标准品是用酶切后的正常人体gDNA和酶切后的插入BRAF基因V600E突变片段的突变质粒按拷贝数比例配制而成，不同突变频率标准品起到不同的作用。标准品采用gDNA和质粒可以最大程度的还原检测样本的特征，给体系的优化提供了很多的基础，在体系优化中起到决定性的作用。(2)本专利技术的BRAF基因V600E突变检测体系通过中突变频率标准品的数字PCR检测结果确定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，使得数据统计的结果更加准确。本专利技术的BRAF基因V600E突变检测体系通过野生型模板的数字PCR检测结果确定检测体系的背景阈值，检测样本的突变拷贝数时，突变拷贝数等于检测结果减去背景阈值，可以使得结果更加准确。(3)本专利技术的BRAF基因V600E突变检测体系通过低突变频率标准品的数字PCR检测结果，可以确定检测体系的灵敏度。(4)本专利技术的BRAF基因V600E突变检测体系通过高突变频率标准品的传统实时荧光PCR检测结果进行探针浓度优化，根据反应前荧光强度(F0)与反应后荧光强度(Fn)差值和比值较大的反应体系为标准，选择合适的探针浓度，该方法结果准确，成本较低。(5)本专利技术的BRAF基因V600E突变检测体系的引物探针为自行设计，探针为MGB探针，探针序列更短，特异性好。引物探针经过多重组合优化选定，扩增效率高，灵敏度高。(6)本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种BRAF基因V600E突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，所述突变型模板是酶切后的插入BRAF基因V600E突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同；采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。

【技术特征摘要】
1.一种BRAF基因V600E突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，所述突变型模板是酶切后的插入BRAF基因V600E突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同；采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。2.根据权利要求1所述的BRAF基因V600E突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品，采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应，根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系，优化野生型探针和突变型探针的使用浓度。3.根据权利要求2所述的BRAF基因V600E突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大，且反...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新泰，王明，潘文健，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31