The invention relates to an optimization method of a digital PCR detection system for EGFR gene L858R mutation, which includes upstream primers, downstream primers, wild-type probes, mutant probes, wild-type templates and mutant templates; wild-type templates are normal human gDNA after enzymatic digestion, and mutant templates are mutant plasmids inserted into the mutant fragment of EGFR gene L858R after enzymatic digestion; The standard products were prepared with wild-type template according to a certain proportion of copies. The fluorescent regions of wild-type and mutant were selected by using digital PCR to react with medium mutation frequency standard products as templates and making statistical data maps based on reaction data. The background thresholds were determined by using the wild-type template as the template for digital PCR. The optimized method for the detection system of EGFR gene L858R mutation by digital PCR has higher detection accuracy.
【技术实现步骤摘要】
EGFR基因L858R突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品
本专利技术涉及检测人类EGFR基因L858R突变的数字PCR检测产品及其优化方法,属于生物
技术介绍
在世界范围内,肺癌是肿瘤性死亡首因,严重危害着人类的健康。全球每年约有150万的人死于肺癌。空气污染的污染,吸烟的影响等都进一步加剧了肺癌的发生。肺癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤的首位。因此,肺癌的早期诊断及治疗一直是研究的终点,也是防治肺癌的关键。表皮生长因子受体(EGFR)属于络氨酸激酶型受体,贯穿细胞膜,其胞内部分为其激酶活性区域,是原癌基因。表皮细胞生长因子受体络氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)对具有EGFR激活突变的非小细胞肺癌(NSCLC)患者具有显著疗效。在NSCLC的组织类型中,亚裔肺腺癌患者的EGFR基因突变率高达60%,其中21号外显子L858R点突变的频率约30%。有研究指出对于具有L858R突变患者靶向治疗和化疗治疗效果相似甚至化疗效果更优。因此,治疗前应对L858R位点进行检测。传统的检测EGFR基因L858R点突变常用的标本为病理组织或细胞学标本,但是组织取材具有创伤性特点。受到肿瘤大小和部位的影响,时常难以取得满意的组织或无法取样。与此同时,随着疾病的进展,需连续进行取样,而组织取样为有创操作无法进行便捷、反复进行。血浆游离DNA(cfDNA)是一种能够代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA(ctDNA)进入外周血。对cfDNA中的ctDNA的检测成为检测肿瘤突变的一种途径。c ...
【技术保护点】
1.一种EGFR基因L858R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入EGFR基因L858R突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。
【技术特征摘要】
1.一种EGFR基因L858R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入EGFR基因L858R突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。2.根据权利要求1所述的EGFR基因L858R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品,采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应,根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系,优化野生型探针和突变型探针的使用浓度。3.根据权利要求2所述的EGFR基因L858R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大,且反...
【专利技术属性】
技术研发人员:赵新泰,王明,潘文健,
申请(专利权)人:上海赛安生物医药科技股份有限公司,
类型:发明
国别省市:上海,31
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