β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种β2‑MG化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法，属于免疫分析的技术领域，解决现有技术灵敏度低、成本高等问题。该试剂盒包括以下试剂：R1：含有链霉亲和素包被的磁珠的液体；R2：含有吖啶酯标记的β2‑MG抗体的液体；R3：含有生物素标记的β2‑MG抗体的液体。本发明专利技术的β2‑MG化学发光免疫分析测定试剂盒具有检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测范围广、稳定性好等优点，可广泛用于β2‑MG的临床检测。

【技术实现步骤摘要】
β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及免疫分析的
，尤其涉及一种β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。
技术介绍
β2-微球蛋白(简称β2-MG)是由Berggard和Bearn于1968年从肾脏患者尿中分离出的一种蛋白质，由于它的分子量为11800，电泳时显于β2区带，故被命名为β2-微球蛋白。β2-MG是人体有核细胞产生的一种由100个氨基酸残基组成的单链多肽低分子蛋白。β2-MG与人类白细胞抗原(HLA)的轻链部分相同，链内含有一对二硫键，β2-MG与HLA-A、B、C抗原的重链非共价的相结合而存在于细胞膜上。一般认为除成熟红细胞和胎盘滋养层细胞外，其它细胞均含有β2-MG。因此，起源于人体间质细胞上皮和造血系统的正常细胞和恶性细胞均能合成β2-MG。它可从有核细胞中脱落进入血循环，使血液中的β2-MG升高。血、尿β2-MG不仅可对肾脏疾病的临床诊断起辅助作用，还可作为肾脏损害程度的指标。正常情况下β2-MG在血液、尿液中含量都很少，血液中β2-MG经肾小球过滤后99.9％被近端小管重吸收。但在发生急、慢性肾炎，肾功能衰竭，肾移植后发生排斥反应等肾脏疾病时β2-MG水平升高。故测定血液β2-MG可作为肾小球滤过率的指标，主要的临床应用在于监测肾小管功能。当血液β2-MG水平上升，可反映肾小球滤过功能下降或体内合成增加，尿液中β2-MG升高，可反映肾小管功能受损和肾小球滤过率增加。此外，据文献报道，多种血液系统及实体性肿瘤患者β2-微球蛋白含量也可异常增高，在淋巴系统中如慢性淋巴细胞白血病、淋巴细胞肉瘤、多发性骨髓瘤等中尤为明显；在肺癌、乳腺癌、胃肠道癌及子宫颈癌等恶性肿瘤患者体内也可见增高。另外，类风湿关节炎，系统性红斑狼疮，肝炎等患者β2-MG水平也可升高。目前用于检测β2-MG的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法。酶联免疫分析法采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体，用于催化发光底物产生颜色变化，操作简单，但是标记物易失活，发光底物需要避光，试剂的检测灵敏度较低，导致测试结果不准确。化学发光免疫分析法采用催化剂催化化学发光物质形成一种激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，发出光子，具有操作简单，自动化程度高，检测速度快等优点。以上定量检测β2-MG的方法存在以下缺陷：1)ELISA方法采用微孔板作为固定性，包被密度有限，灵敏度较低，反应时间较长；2)采用异鲁米诺衍生物直接标记抗体，采用FITC抗体-FITC将FER抗体间接偶联至磁珠表面，引入更多的影响因素，影响结果的检测。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术问题，提供一种β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法，该试剂盒用于定量检测人血清/尿液中的β2-MG含量，具有灵敏度高，操作简单，成本低等优点。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒，包括以下试剂：R1：含有链霉亲和素包被的磁珠的液体；R2：含有吖啶酯标记的β2-MG抗体的液体；R3：含有生物素标记的β2-MG抗体的液体；其中，R1中链霉亲和素包被的磁珠的浓度为0.05％-0.1％；R2中β2-MG抗体与吖啶酯的摩尔比为1:3-1:15；吖啶酯标记的β2-MG抗体的浓度为0.1-0.5μg/ml；R3中β2-MG抗体与生物素的摩尔比为1:3-1:15；生物素标记的β2-MG抗体的浓度为0.5-3μg/ml；R1缓冲液的pH值为7.0-8.0，R2和R3缓冲液的pH值均为6.0-6.8。进一步地，上述的检测β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒，还包括两点企业校准品，校准品中含有β2-MG的浓度分别为0.1mg/L和2mg/L。进一步地，校准品缓冲液为含有20％小牛血清的100mMPBS缓冲液。进一步地，R1的制备方法为：取浓度为100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液，加入20倍体积的TBST溶液充分混匀10分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒；重复清洗3次后用含有0.05％吐温和0.02％叠氮钠、pH7.0-8.0的25mMTris缓冲液配成磁珠浓度为0.05％-0.1％的固相试剂R1。进一步地，R2的制备方法为：将β2-MG抗体加入50mM-200mMPBS缓冲溶液，将β2-MG抗体与吖啶酯按摩尔体积比1:3-1:15混合，充分混匀；室温放置2-4小时后，加入1mL20％赖氨酸封闭液，混匀，封闭时间为1h；封闭后对吖啶酯标记抗体溶液进行纯化，收取纯化后溶液，用含有0.05％吐温、pH6.0-6.8的400mMBistris缓冲液稀释至终浓度为0.1-0.5μg/ml的试剂R2。进一步地，R3的制备方法为：将β2-MG抗体加入50mM-200mMPBS缓冲溶液，将β2-MG抗体与生物素按摩尔体积比1:3-1:15混合，充分混匀，室温放置2-4小时后，对生物素标记抗体溶液进行纯化，收取纯化后溶液，用含有1％BSA、pH6.0-6.8的400mMBistris缓冲液将纯化后的抗体配制成终浓度为0.5-3μg/ml的试剂R3。进一步地，上述纯化步骤采用的是AKTA蛋白纯化仪。本专利技术还提供了上述的β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：S1、制备试剂R1，R1的制备方法为：取浓度为100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液，加入20倍体积的TBST溶液充分混匀10分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒；重复清洗3次后用含有0.05％吐温和0.02％叠氮钠、pH7.0-8.0的25mMTris缓冲液配制成磁珠浓度为0.05％-0.1％的固相试剂R1；S2、制备试剂R2，R2的制备方法为：将β2-MG抗体加入50mM-200mMPBS缓冲溶液，将β2-MG抗体与吖啶酯按摩尔体积比1:3-1:15混合，充分混匀；室温放置2-4小时后，加入1mL20％赖氨酸封闭液，混匀，封闭时间为1h；封闭后对吖啶酯标记抗体溶液进行纯化，收取纯化后溶液，用含有0.05％吐温、pH6.0-6.8的400mMBistris缓冲液稀释至终浓度为0.1-0.5μg/ml的试剂R2；S3、制备试剂R3，R3的制备方法为：将β2-MG抗体加入50mM-200mMPBS缓冲溶液，将β2-MG抗体与生物素按摩尔体积比1:3-1:15混合，充分混匀，室温放置2-4小时后，对生物素标记抗体溶液进行纯化，收取纯化后溶液，用含有1％BSA、pH6.0-6.8的400mMBistris缓冲液将纯化后的抗体配制成终浓度为0.5-3μg/ml的试剂R3。本专利技术还提供了上述的β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1)将待测样本与R2及R3试剂孵育10min，样本中β2-MG抗原与生物素标记β2-MG第一抗体、吖啶酯标记的β2-MG第二抗体发生免疫反应，形成生物素-β2-MG抗体-β2-MG-β2-MG抗体-吖啶酯溶剂；2)再加入R1试剂孵育10min，链霉亲和素磁珠与生物素结合，形成磁珠-链霉亲和素-生物素-β2-MG抗体-β2-MG-β2-MG抗体-吖啶酯复合物；3)加入清洗缓冲液洗涤，将未反应的溶液清洗去除；4)加入酸性激发液，使吖啶酯标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.β2‑MG化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：R1：含有链霉亲和素包被的磁珠的液体；R2：含有吖啶酯标记的β2‑MG抗体的液体；R3：含有生物素标记的β2‑MG抗体的液体；其中，R1中链霉亲和素包被的磁珠的浓度为0.05％‑0.1％；R2中β2‑MG抗体与吖啶酯的摩尔比为1:3‑1:15；吖啶酯标记的β2‑MG抗体的浓度为0.1‑0.5μg/ml；R3中β2‑MG抗体与生物素的摩尔比为1:3‑1:15；生物素标记的β2‑MG抗体的浓度为0.5‑3μg/ml；R1缓冲液的pH值为7.0‑8.0，R2和R3缓冲液的pH值均为6.0‑6.8。

【技术特征摘要】
1.β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：R1：含有链霉亲和素包被的磁珠的液体；R2：含有吖啶酯标记的β2-MG抗体的液体；R3：含有生物素标记的β2-MG抗体的液体；其中，R1中链霉亲和素包被的磁珠的浓度为0.05％-0.1％；R2中β2-MG抗体与吖啶酯的摩尔比为1:3-1:15；吖啶酯标记的β2-MG抗体的浓度为0.1-0.5μg/ml；R3中β2-MG抗体与生物素的摩尔比为1:3-1:15；生物素标记的β2-MG抗体的浓度为0.5-3μg/ml；R1缓冲液的pH值为7.0-8.0，R2和R3缓冲液的pH值均为6.0-6.8。2.根据权利要求1所述的β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，还包括两点企业校准品，校准品中含有β2-MG的浓度分别为0.1mg/L和2mg/L。3.根据权利要求2所述的β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，校准品的缓冲液为含有20％小牛血清的100mMPBS缓冲液。4.根据权利要求1所述的β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，R1的制备方法为：取浓度为100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液，加入20倍体积的TBST溶液充分混匀10分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒；重复清洗3次后用含有0.05％吐温和0.02％叠氮钠、pH7.0-8.0的25mMTris缓冲液配成磁珠浓度为0.05％-0.1％的固相试剂R1。5.根据权利要求1所述的β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，R2的制备方法为：将β2-MG抗体加入50mM-200mMPBS缓冲溶液，将β2-MG抗体与吖啶酯按摩尔体积比1:3-1:15混合，充分混匀；室温放置2-4小时后，加入1mL20％赖氨酸的封闭液，混匀，封闭时间为1h；封闭后对吖啶酯标记抗体溶液进行纯化，收取纯化后溶液，用含有0.05％吐温、pH6.0-6.8的400mMBistris缓冲液稀释至终浓度为0.1-0.5μg/ml的试剂R2。6.根据权利要求1所述的β2-MG化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，R3的制备方法为：将β2-MG抗体加...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘杨，翟涛，高威，孙成艳，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22