本发明专利技术公开了一种生防用甲基营养型芽孢杆菌菌株(Bacillus methylotrophicus)及其应用，该菌Bacillus methylotrophicus BCN2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No：16443。本发明专利技术包括菌株的分离培养及16S rDNA分子鉴定；甲基营养型芽孢杆菌挥发性物质对枇杷表面常见的腐败真菌(尖孢镰刀菌、葡萄座腔菌属、深绿木霉、胶孢炭疽菌、扩展青霉)在双区平板和枇杷果品上有效的抑制效果；该挥发性物质在枇杷贮藏中的防腐应用。利用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BCN2产生的挥发性抑菌物质可不直接接触果品，实现对果品的保鲜，延长食品的储存时间，可用于制备抑制尖孢镰刀菌、葡萄座腔菌属、深绿木霉、胶孢炭疽菌、扩展青霉等腐败菌，具有较宽抑菌谱的生防用保鲜剂。
【技术实现步骤摘要】
一种生防用甲基营养型芽孢杆菌菌株及其用途
本专利技术涉及一类由甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)BCN2产生的挥发性抑菌物质及其对枇杷采后病害进行防治的生物
，属于食品保鲜
技术介绍
水果采后病害导致的巨大损耗已成为国内外关注的问题，在发达国家约有10％-30％的新鲜果品由于采后病害导致腐烂损失，在发展中国家果品的采后腐烂更为严重。目前，水果采后病害的防治方法主要有化学杀菌剂、气调贮藏、低温防病、热处理等，其中化学防腐效果最好。生物防治没有化学防腐保鲜带来的环境污染、农药残留及连续使用产生抗药性的问题，因此其成为果蔬采后病害防治的主要手段。水果采后腐败主要由霉菌等微生物污染引起，引起枇杷腐败的真菌主要有青霉、链格孢菌、灰葡萄孢菌、炭疽真菌等。芽孢杆菌是目前生防用细菌中研究较多的一类，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，所以是理想的生防用筛选对象。芽孢杆菌可以产生一系列的挥发性物质(VOCs)，包括醇类，醛类，胺类，酮类，萜类，芳香族和氯化烃类以及含硫化合物。有许多研究者发现芽孢杆菌这些挥发性化合物对霉菌有显著的拮抗作用。黄福兴等研究发现，枯草芽孢杆菌BS-2所产生的挥发性物质对木霉Trichoderma菌丝的生长及孢子萌发有显著的抑制作用[1]。挥发物的生防用作用机制主要为改变霉菌蛋白质表达和特定酶的活性或通过增加细胞膜的通透性，从而降低膜相关酶的活性和减少营养摄取。甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)是MunusamyMadhaiyan等人2010年报道自水稻根系土壤中分离得到的一个新种[2]；殷晓敏等人报道甲基营养型芽孢杆菌培养发酵液能导致西瓜尖孢镰刀菌分生孢子不能正常萌发，失去致病力，病菌菌丝体畸形膨大从而不能侵染寄主植株[3]；甲基营养型芽孢杆菌在防治番茄早疫病和稻白叶枯病的研究已有报道[4-6]，如吕倩等首次从海洋中分离得到并证实此菌具备较强抑制黄瓜炭疽病菌等病原真菌活性的能力，有防治作物真菌病害的利用潜质[6]。但关于甲基营养型芽孢杆菌产生的挥发性物质很少被报道。本专利技术将利用甲基营养型芽孢杆菌产生的挥发性物质的拮抗性，制备一种防治枇杷采后腐败的制剂。参考文献：[1]黄福兴.枯草芽孢杆菌BS-2对病原真菌的抑制作用及其活性成分分析[D].福建农林大学,2008.[2]朱玮,赵兵,王晓东,等.生物农药苏云金芽孢杆菌的研究进展[J].过程工程学报,2004,3:282-288.[3]殷晓敏,吴琼,金志强.甲基营养型芽孢杆菌对西瓜枯萎病菌拮抗作用的研究[J].热带农业科学,2017,11:54-60.[4]刘利强,杨士玲,陈强,等.30亿个/g甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂防治黄瓜灰霉病田间药效试验[J].现代农业科技,2014,9:130-133.[5]MadhaiyanM,PoonguzhaliS,KwonSoonWo,etal.Bacillusmethylotrophicussp.nov,amethanol-utilizing,plant-growth-promotingbacteriumisolatedfromricerhizospheresoil[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2010,10:2490-2495.[6]吕倩,胡江春,王楠,等.南海深海甲基营养型芽孢杆菌SHB114抗真菌脂肽活性产物的研究[J].中国生物防治学报,2014,1:113-120.
技术实现思路
本专利技术公开了一种能产生对多种枇杷病原菌具有拮抗作用的挥发性化合物的生防用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)。利用该挥发性物质可开发出新型的食品保鲜剂。经16SrDNA菌种鉴定，该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，保藏名称为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)BCN2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo:16443，保藏日期为2018年09月10日。所述菌株的单菌落为圆形、白色、不透明、表面干燥、边缘粗糙、表面略褶皱。菌株需氧性试验结果显示为兼性厌氧，分离自北京野生动物园采集的昆虫体内。本专利技术的甲基营养型芽孢杆菌BCN2，其16SrDNA序列长度为1443bp，具体序列如SEQIDNO1所示。本专利技术的甲基营养型芽孢杆菌BCN2，具有较广的抑菌谱，对引起枇杷采后病害的病原菌以及尖孢镰刀菌、葡萄座腔菌属、扩展青霉、深绿木霉、胶孢炭疽菌等病原菌都有较强的抑制效果。所述的生防用甲基营养型芽孢杆菌菌株可以用于制备防治枇杷采后腐败的芽孢杆菌菌剂。本专利技术的甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法为：将所述的菌株在LB培养基中22-37℃培养12-16h；然后重复传代培养2次，挑取适量甲基营养型芽孢杆菌(1mm×1mm)加入到含有50mLLB液体培养基的锥形瓶中，在150-200rpm、22-37℃的摇床中振荡培养12-16h。最佳培养条件为：发酵起始pH为6.0、发酵时间12-16h、发酵温度22-37℃。本专利技术公开了一种防治枇杷采后腐败的方法：1)将所述甲基营养型芽孢杆菌菌株接种于LB培养基中得培养液，或使用其发酵液；稀释培养液或发酵液，使得菌浓度为107-1010CFU/mL；2)将枇杷与步骤1)中稀释后的培养液或发酵液按照1kg：0.3L的比例放在同一密闭空间进行熏蒸，保持80％-95％的相对湿度，置于22-30℃下保藏。本专利技术还公开了一种含有基营养型芽孢杆菌的发酵液的生物保鲜剂，其成分为，每毫升生物保鲜剂中含有解淀粉芽孢杆菌107-1010个，其余是培养基。在近于密闭的条件下施用，对水果进行熏蒸。这种生防用甲基营养型芽孢杆菌菌剂，其特征在于产生活性挥发性物质。本专利技术所述的挥发性物质有以下特点：1.甲基营养型芽孢杆菌BCN2菌株具有较广的抑菌谱，对多种枇杷病原菌的生长有抑制作用。2.甲基营养型芽孢杆菌BCN2菌株对采后枇杷具有保鲜作用，能有效抑制因病原菌引起的枇杷腐败。3.此菌剂生产工艺简单、周期短，便于工业化生产和运输。4.利用甲基营养型芽孢杆菌BCN2产生的挥发性抑菌物质可不直接接触果品，实现对果品的保鲜，延长食品的储存时间。附图说明图1生防用甲基营养型芽孢杆菌BCN2与相似菌株16SrDNA序列的NJ系统发育树，与已知菌株甲基营养型芽孢杆菌BacillusmethylotrophicusCBMB205(NR_116240.1)的16SrDNA同源性最高，结合菌体形态、菌落特征及生理生化指标的测定结果，将其鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)；图2BCN2产生的挥发性物质对5种霉菌病斑直径的影响；图3BCN2产生的挥发性物质对5种霉菌发病率的影响。具体实施方式PDA培养基：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂、1000mL水。LB培养基：10g氯化钠、10g胰蛋白胨、5g酵母浸出物、20g琼脂、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生防用甲基营养型芽孢杆菌菌株，其特征在于：保藏名称为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BCN2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:16443，保藏日期为2018年09月10日。
【技术特征摘要】
1.一种生防用甲基营养型芽孢杆菌菌株，其特征在于：保藏名称为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)BCN2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo:16443，保藏日期为2018年09月10日。2.根据权利要求1所述的生防用甲基营养型芽孢杆菌菌株，其特征在于：菌体为杆状，为兼性厌氧发酵型，所述菌株的单菌落为圆形、白色、不透明、表面干燥。3.根据权利要求1所述的生防用甲基营养型芽孢杆菌菌株，其特征在于：其16SrDNA序列如SEQIDNO1所示。4.一种如权利要求1所述菌株的发酵方法，其特征在于：将权利要求1所述的菌株在LB培养基中22-37℃培养12-...
【专利技术属性】
技术研发人员：周文文，何超男，孙亚芳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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