一种凉粉草酸性多糖的脱色方法技术

本发明专利技术公开了一种超声‑双氧水结合大孔树脂的凉粉草酸性多糖的脱色方法，包括原料预处理、乙醇除杂、弱碱水提、粗多糖酶解、凉粉草多糖浓缩液超声‑双氧水脱色、AKTA‑大孔树脂层析系统脱色、透析、离心、多糖的获得这9个步骤，操作简便，本发明专利技术操作条件温和，脱色期较短，多糖得率较高，综合成本较低的凉粉草酸性多糖的脱色。

【技术实现步骤摘要】
一种凉粉草酸性多糖的脱色方法
本专利技术专利涉及从凉粉草中提取的凉粉草酸性多糖的一种脱色方法，属于天然产物生物活性物质的提取分离纯化领域，包括提取、滤液预处理、脱色等相关技术。
技术介绍
凉粉草(Mesonachinesis)又名仙草、仙人草、仙人冻、薪草，系唇形科仙草属一年生草本植物，在我国具有多年食用和药用历史。凉粉草主要分布在中国以及印度、越南、缅甸等东南亚国家，我国以福建省和广东省的栽培面积最大，广泛分布于江西、广东、福建、广西、云南等地。作为药食两用植物资源，凉粉草具有很高营养价值和潜在医疗保健作用，主治中暑、热毒、糖尿病、烧烫伤、黄疸、痢疾、关节肌肉疼痛、肾脏病等。凉粉草资源丰富、价格低廉且可食用，多糖是凉粉草中主要的生物活性物质。具有抗氧化、免疫调节，降血糖等多种生理功能。目前，凉粉草多糖的提取方法有纤维素酶提取法、传统水煮法、热水碱提法，也有在碱提基础上，采用高温高压、微波辅助、超声辅助提取。但提取的凉粉草多糖色泽呈黑褐色，其色泽不仅影响多糖的质量与纯度，影响到多糖的分离纯化、结构鉴定及其构效关系研究，最终影响到多糖产品的质量。传统的生产工艺采取吸附法进行脱色，操作工时长，在10小时以上。吸附法多选用白陶土或活性炭作为吸附剂，操作繁琐，且吸附剂均可吸附目标产品，造成多糖的得率低、纯度也不高，活性多糖成分损失较大，难以满足市场需求，超声-过氧化氢联合大孔树脂法用以去除凉粉草多糖色素尚未见有文献报道。
技术实现思路
一种凉粉草酸性多糖的脱色方法：具体包括以下步骤：(1)原料预处理：净选凉粉草，清除杂草、腐叶，将原料凉粉草粉碎至10～40目待用；(2)乙醇除杂：第一次加入6～8倍凉粉草重量的75％的乙醇先浸泡12～24h，第二次用4～5倍量70％乙醇浸泡6～12h，将凉粉草放入通风橱待乙醇挥发完全后，再移至40℃烘箱烘干，得到脱脂凉粉草粉末；(3)弱碱水提：将上述挥干乙醇的凉粉草用浓度为0.5～2.0％的碳酸钠水溶液、控制料液比为1:20～1:10，80～95℃下提取，提取时间2～4h，浸提后稍微冷却，趁热用纱布过滤，滤液离心，收集滤液，滤渣反复提取两次，合并滤液，将提取液用旋转蒸发仪旋蒸真空浓缩，减压低温至原滤液的1/3体积后，于4℃保存备用；(4)粗多糖酶解：将步骤(3)中得到的浓缩滤液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3-5w/w％，于35～45℃反应30～60min，酶解后将酶解液置于沸水灭酶5min，将灭酶后的酶解液进行离心控制离心转速为4800rpm，时间5min，取上清液，备用；(5)凉粉草多糖上清液超声-双氧水脱色：将步骤(4)中所得的凉粉草多糖上清液在中加入浓度为30％的双氧水，用氨水调节pH8～10，混匀，所述的双氧水占凉粉草多糖上清液体积比的2～5％，其中超声功率：100～150W，超声时间0.5～1h，温度35～45℃，同时搅拌，双氧水脱色机理为：H2O2+·OH→H2O+·HO2·HO2+·OH→H2O+O2·OH+·OH→H2O2；(6)AKTA-大孔树脂层析系统脱色：将所述上清液通过AKTA-AB-8大孔吸附树脂层析系统进行脱色，其取经预处理的AB-8大孔树脂于250mL三角瓶中，装入内径为50mm的层析柱，高度为600mm，上样量为18-20mL，流速为1-1.5mL/min；以示差检测器在线检测多糖，紫外检测器在线辅助检测蛋白质；根据在线检测情况收集多糖组分；多糖组分富集、在50℃～60℃下减压浓缩；(7)透析：使用透析袋，所述透析袋截留分子量为9000，将AKTA-大孔树脂层析系统脱色后收集的多糖进行透析处理，然后通过旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3～1/4；(8)离心：控制离心转速为4500rpm，离心10min，在浓缩液中加入无水乙醇，丙酮，静置、离心，收集沉淀；(9)多糖的获得：沉淀用蒸馏水在超声波清洗器中超声辅助溶解后，进行透析，所述透析袋截留分子量14000、减压浓缩、冷冻干燥处理，即得到脱色的多糖。本专利技术的有益效果操作简便，操作条件温和，脱色期较短，多糖得率较高，综合成本较低的凉粉草酸性多糖的脱色。附图说明图1为实施例凉粉草多糖溶液脱色前全波长扫描图谱；图2为实施例凉粉草多糖溶液的脱色率与pH的关系；图3为实施例凉粉草多糖溶液的脱色率与AB-8大孔树脂、双氧水法的比较；图4为实施例凉粉草多糖的高效凝胶渗透色谱(HPGPC)图；图5为实施例凉粉草酸性多糖的气相色谱图；图6为实施例凉粉草酸性多糖的红外光谱。具体实施方式实施例1脱色：净选凉粉草，清除杂草、腐叶等，将原料凉粉草粉碎至20目待用，取凉粉草100g，第一次加入8倍凉粉草重量的80％的乙醇先浸泡12h，第二次用5倍量80％醇浸泡6h，将凉粉草放入通风橱待乙醇挥发完全后，再移至40℃烘箱烘干，得到脱脂凉粉草粉末。将上述挥干乙醇的凉粉草用浓度为0.5％的碳酸钠水溶液、料液比1:20，80℃下提取，提取时间2h，浸提后稍微冷却，趁热用纱布过滤，滤液离心，收集滤液，滤渣反复提取两次，合并滤液。将提取液用旋转蒸发仪旋蒸真空浓缩，减压低温至原滤液的1/3体积后，4℃保存备用。滤液加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3w/w％，40℃反应60min，得多糖的酶解液，酶解后将酶解液置于沸水(100℃)灭酶5min，将灭酶后的酶解液进行离心(4800rpm,5min)，取上清液备用。在凉粉草多糖酶解液在中加入浓度为30％的双氧水，用氨水调节pH9，混匀，所述的双氧水占凉粉草多糖酶解液的2％(v/v)在超声功率：120W，搅拌45℃下超声时间1h。将所述上清液通过AKTA-AB-8大孔吸附树脂层析系统进行脱色，其取经预处理的AB-8大孔树脂于250mL三角瓶中，装入内径为50mm的层析柱，高度为600mm，上样量为18-20mL，流速为1-1.5mL/min；以示差检测器在线检测多糖，紫外检测器在线辅助检测蛋白质等；根据在线检测情况收集多糖组分；多糖组分富集、在50℃～60℃下减压浓缩至与上样量等同体积。取上清液在波长420nm处测定吸光度，计算脱色率，测定多糖含量，计算多糖保留率。使用透析袋，所述透析袋截留分子量为9000，将AKTA-大孔树脂层析系统脱色后收集的多糖进行透析处理，然后通过旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3；离心4500rpm，10min，在浓缩液中加入无水乙醇，丙酮，静置、离心，收集沉淀。沉淀用蒸馏水在超声波清洗器中超声辅助溶解后，进行透析，截留分子量9000、减压浓缩、冷冻干燥处理，得到脱色的多糖。检测：对浓度为约为0.5mg/mL凉粉草多糖液在紫外可见分光光度计于400～900nm波长范围内进行扫描，见说明书附图2，发现溶液从400nm到900nm吸收呈递减趋势，凉粉草多糖在可见光区无最大吸收峰，选择420nm波长，将待测多糖液调节至初始pH后于420nm下测定吸光度值，按下式计算脱色率。结果测定其脱色率为80.1％。脱色率(％)＝(A1脱色前吸光度值–A2脱色后测定的吸光度值)/A1脱色前吸光度值)×100％。多糖含量的计算：多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，配制0.5mg/mL多糖样品溶液，取脱色前后待测液各2.0ml，加质量分数为5％的重蒸苯酚1.0ml及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凉粉草酸性多糖的脱色方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)原料预处理：净选凉粉草，清除杂草、腐叶，将原料凉粉草粉碎至10～40目待用；(2)乙醇除杂：第一次加入6～8倍凉粉草重量的75％的乙醇先浸泡12～24h，第二次用4～5倍量70％乙醇浸泡6～12h，将凉粉草放入通风橱待乙醇挥发完全后，再移至40℃烘箱烘干，得到脱脂凉粉草粉末；(3)弱碱水提：将上述挥干乙醇的凉粉草用浓度为0.5～2.0％的碳酸钠水溶液、控制料液比为1:20～1:10，80～95℃下提取，提取时间2～4h，浸提后稍微冷却，趁热用纱布过滤，滤液离心，收集滤液，滤渣反复提取两次，合并滤液，将提取液用旋转蒸发仪旋蒸真空浓缩，减压低温至原滤液的1/3体积后，于4℃保存备用；(4)粗多糖酶解：将步骤(3)中得到的浓缩滤液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3‑5w/w％，于35～45℃反应30～60min，酶解后将酶解液置于沸水灭酶5min，将灭酶后的酶解液进行离心控制离心转速为4800rpm，时间5min，取上清液，备用；(5)凉粉草多糖上清液超声‑双氧水脱色：将步骤(4)中所得的凉粉草多糖上清液在中加入浓度为30％的双氧水，用氨水调节pH 8～10，混匀，所述的双氧水占凉粉草多糖上清液体积比的2～5％，其中超声功率：100～150W，超声时间0.5～1h，温度35～45℃，同时搅拌，双氧水脱色机理为：H2O2+·OH→H2O+·HO2·HO2+·OH→H2O+O2·OH+·OH→H2O2；(6)AKTA‑大孔树脂层析系统脱色：将所述上清液通过AKTA‑AB‑8大孔吸附树脂层析系统进行脱色，其取经预处理的AB‑8大孔树脂于250mL三角瓶中，装入内径为50mm的层析柱，高度为600mm，上样量为18‑20mL，流速为1‑1.5mL/min；以示差检测器在线检测多糖，紫外检测器在线辅助检测蛋白质；根据在线检测情况收集多糖组分；多糖组分富集、在50℃～60℃下减压浓缩；(7)透析：使用透析袋，所述透析袋截留分子量为9000，将AKTA‑大孔树脂层析系统脱色后收集的多糖进行透析处理，然后通过旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3～1/4；(8)离心：控制离心转速为4500rpm，离心10min，在浓缩液中加入无水乙醇，丙酮，静置、离心，收集沉淀；(9)多糖的获得：沉淀用蒸馏水在超声波清洗器中超声辅助溶解后，进行透析，所述透析袋截留分子量14000、减压浓缩、冷冻干燥处理，即得到脱色的多糖。...

【技术特征摘要】
1.一种凉粉草酸性多糖的脱色方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)原料预处理：净选凉粉草，清除杂草、腐叶，将原料凉粉草粉碎至10～40目待用；(2)乙醇除杂：第一次加入6～8倍凉粉草重量的75％的乙醇先浸泡12～24h，第二次用4～5倍量70％乙醇浸泡6～12h，将凉粉草放入通风橱待乙醇挥发完全后，再移至40℃烘箱烘干，得到脱脂凉粉草粉末；(3)弱碱水提：将上述挥干乙醇的凉粉草用浓度为0.5～2.0％的碳酸钠水溶液、控制料液比为1:20～1:10，80～95℃下提取，提取时间2～4h，浸提后稍微冷却，趁热用纱布过滤，滤液离心，收集滤液，滤渣反复提取两次，合并滤液，将提取液用旋转蒸发仪旋蒸真空浓缩，减压低温至原滤液的1/3体积后，于4℃保存备用；(4)粗多糖酶解：将步骤(3)中得到的浓缩滤液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3-5w/w％，于35～45℃反应30～60min，酶解后将酶解液置于沸水灭酶5min，将灭酶后的酶解液进行离心控制离心转速为4800rpm，时间5min，取上清液，备用；(5)凉粉草多糖上清液超声-双氧水脱色：将步骤(4)中所得的凉粉草多糖上清液在中加入浓度为30％的双氧水，用氨水调节pH8～...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢建华，林丽华，黄莉鑫，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36