网织红细胞模拟物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种网织红细胞模拟物及其制备方法与应用，属于血液质控物技术领域。解决了如何提供一种操作简单、产率更高、稳定性更好的网织红细胞模拟物及其制备方法与应用。本发明专利技术的制备方法，步骤如下：步骤一、分离洗涤红细胞，得到纯化红细胞；步骤二、用稀释液稀释纯化红细胞，加入加载剂，在脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内；步骤三、向引入加载体后的细胞中加入固定液，室温固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到网织红细胞模拟物。该模拟物制备步骤简单，适合大批量生产，可作为全自动血细胞分析仪检测网织红细胞的质量控制物应用。

【技术实现步骤摘要】
网织红细胞模拟物及其制备方法与应用
本专利技术属于血液质控物
，具体涉及一种网织红细胞模拟物及其制备方法与应用。
技术介绍
由单一或多组分的血细胞或血细胞模拟物组成的血液质控品，具备如同血液一样的可检测的特性，可以用于血液分析仪的准确性和精确性的日常监控。网织红细胞是红细胞成熟过程中的过渡阶段的细胞，是未成熟的红细胞，其特征是刚脱去细胞核、胞质内尚残留有少量RNA。网织红细胞的总数或百分比对于临床上对贫血及其相关疾病的诊断具有重要的临床意义。网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标，主要表现在以下几个方面。1、评价骨髓增生能力，判断贫血类型：①网织红增多，表示骨髓造血功能旺盛，常见于各种增生性贫血如缺铁性贫血、巨幼细胞性(缺乏叶酸、维生素B12)贫血、失血性贫血，尤以溶血性贫血时增加最为显著，常>10％。造血恢复期可见RET短暂和迅速增高，是骨髓功能恢复较敏感的指标。②网织红减少：常见于再生障碍贫血，网织红细胞计数常低于0.005，网织红细胞绝对值低于15×109/L。2、评价疗效：①观察贫血疗效，RET是贫血患者随访检查的项目之一；②骨髓移植后监测骨髓造血恢复。3、放疗和化疗的监测：网织红细胞的动态观察可指导临床适时调整治疗方案，避免造成严重的骨髓抑制。综上所述，网织红细胞的各项指标在贫血性疾病的诊断和治疗效果的评估方面具有重要的临床意义，近年的研究发现，网织红细胞参数在检测肝硬化过程中也具有重要的临床意义。目前中高端的血细胞分析仪都将网织红细胞作为分析和检测的指标，对血液样本中网织红细胞的分析已成为血液分析的重要组成部分，使用质控物对网织红细胞计数进行质量控制是保证血细胞分析仪测定结果准确性的前提，因此开发出准确的可用于全自动血细胞分析仪的网织红细胞质控物是十分必要的。当前对于网织红细胞质控物的制备主要有以下几种方式：1、以猪血的网织红细胞为原料，通过离心分离等方法分离出网织红细胞，制备网织红细胞质控品(US5736402，US5858789，US5945340，US6444471)，这种制备方法原料的处理量大，产率不好，血小板的分离可能不彻底，所需成本较高。2、将哺乳动物的红细胞膜进行处理后，注入核酸物质，模拟网织红细胞，制备网织红细胞质控品(US6399388，US6406915，US5432089)，该方法制得的产物是红细胞和网织红细胞的混合物，网织红细胞的产率取决于核酸注入的比例多少，并且操作过程繁琐。3、通过核酸等物质与红细胞膜表面共价结合的方式制备网织红细胞模拟物(US7195919)，该方法制备的网织红细胞质控品的储存效期取决于核酸与细胞表面连接的强度，在长期储存时难以保证效期，并且操作繁琐。4、分离纯化哺乳动物无核红细胞，通过加入细胞处理液和固定液制备网织红细胞质控品(CNCN101881778)，该制备方法操作过程相对简单，但是其制备过程中利用蛋白质变性剂使细胞内的分子结构发生改变以达到与染料的吸附作用，蛋白变性剂的作用程度会影响网织红细胞模拟物的产率。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种操作简单、产率更高、稳定性更好的网织红细胞模拟物及其制备方法与应用。本专利技术的网织红细胞模拟物的制备方法，步骤如下：步骤一、分离洗涤红细胞，得到纯化红细胞；步骤二、用稀释液稀释纯化红细胞，加入加载剂，在脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内；所述稀释液由体积比为1:(30-50)的稀释液I和稀释液II组成；稀释液I由ATP、MgCl2和水组成，ATP的浓度为10％-40％，MgCl2的浓度为5％-28％；稀释液II由KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖和水组成，稀释液II的PH值为7.0-7.5，KH2PO4浓度为0.5％-2.0％，NaHCO3浓度为0.05％-0.2％，葡萄糖的浓度0.01％-0.1％；步骤三、向引入加载体后的细胞中加入固定液，18-28℃固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到网织红细胞模拟物。优选的是，所述红细胞为人红细胞或者MCV与人红细胞类似的哺乳动物红细胞。优选的是，用稀释液稀释纯化红细胞至1012-1014个/L。优选的是，所述加载体为人工合成100bp-2000bp的DNA片段或人工合成的RNA片段，加载体的用量为1.0-1.5μg/L。优选的是，将脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内的过程为：电穿孔仪器90-120V电压刺激4-8秒钟。优选的是，所述细胞固定液为甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇中的一种或多种，固定时间为3-5小时。优选的是，步骤一和步骤三中洗涤采用的洗涤液为PBS缓冲液、D-HANKS缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液、氯化钠缓冲液或硼酸缓冲液。优选的是，所述细胞保存液包括缓冲液、营养成分和防腐剂。本专利技术还提供上述网织红细胞模拟物的制备方法制备的网织红细胞模拟物。本专利技术还提供上述网织红细胞模拟物作为全自动血细胞分析仪检测网织红细胞的质量控制物的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术的网织红细胞模拟物的制备方法，运用电脉冲刺激细胞的方式将核酸物质引入成熟红细胞内制备出网织红细胞模拟物，该模拟物制备步骤简单，适合大批量生产。本专利技术的网织红细胞模拟物，由人或者哺乳动物的红细胞，通过脉冲处理引入核酸或其类似物后对细胞进行固定处理，进而模拟网织红细胞的状态，制备出网织红细胞模拟物。附图说明图1为实施例1所制备的网织红细胞模拟物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供RET通道)。图2为实施例2所制备的网织红细胞模拟物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅RET通道)。图3为实施例3所制备的网织红细胞模拟物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅RET通道)。图4为实施例4所制备的网织红细胞模拟物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅RET通道)。具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面对本专利技术优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本专利技术的特征和优点，而不是对本专利技术权利要求的限制。本专利技术的网织红细胞模拟物的制备方法：先分离洗涤红细胞，得到纯化红细胞；然后将纯化红细胞加入稀释液中，加入加载剂，经脉冲电场的作用将加载剂导入到纯化红细胞内，最后向引入加载体后的细胞中加入固定液，18-28℃固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到网织红细胞模拟物。上述技术方案中，红细胞可以是人的红细胞，也可以是MCV值与人接近的哺乳动物的红细胞，以新鲜血液制备本专利技术中的模拟物效果更佳。分离方法是通过离心、洗涤、过滤的方式去除血液样本中的白细胞和血小板，其中，过滤可以用白细胞滤器去除白细胞。上述技术方案中，稀释液为稀释液I和稀释液II组成，稀释液I和稀释液II的体积比为1:(30-50)，优选为1:(32-42)，最优选为1:40。其中，稀释液I由ATP、MgCl2和水组成；ATP的浓度为10％-40％，优选为15％-35％，更优选为20％-30％；MgCl2的浓度为5％-28％，优选为8％-20％，更优选为10％-15％。稀释液II由KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖和水组成；稀释液II的PH值为7.0-7.5，优选为7.2-7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.网织红细胞模拟物的制备方法，其特征在于，步骤如下：步骤一、分离洗涤红细胞，得到纯化红细胞；步骤二、用稀释液稀释纯化红细胞，加入加载剂，在脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内；所述稀释液由体积比为1:(30‑50)的稀释液I和稀释液II组成；稀释液I由ATP、MgCl2和水组成，ATP的浓度为10％‑40％，MgCl2的浓度为5％‑28％；稀释液II由KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖和水组成，稀释液II的PH值为7.0‑7.5，KH2PO4的浓度为0.5％‑2.0％，NaHCO3的浓度为0.05％‑0.2％，葡萄糖的浓度0.01％‑0.1％；步骤三、向引入加载体后的细胞中加入固定液，18‑28℃固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到网织红细胞模拟物。

【技术特征摘要】
1.网织红细胞模拟物的制备方法，其特征在于，步骤如下：步骤一、分离洗涤红细胞，得到纯化红细胞；步骤二、用稀释液稀释纯化红细胞，加入加载剂，在脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内；所述稀释液由体积比为1:(30-50)的稀释液I和稀释液II组成；稀释液I由ATP、MgCl2和水组成，ATP的浓度为10％-40％，MgCl2的浓度为5％-28％；稀释液II由KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖和水组成，稀释液II的PH值为7.0-7.5，KH2PO4的浓度为0.5％-2.0％，NaHCO3的浓度为0.05％-0.2％，葡萄糖的浓度0.01％-0.1％；步骤三、向引入加载体后的细胞中加入固定液，18-28℃固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到网织红细胞模拟物。2.根据权利要求1所述的网织红细胞模拟物的制备方法，其特征在于，所述红细胞为人红细胞或者MCV与人红细胞类似的哺乳动物红细胞。3.根据权利要求1所述的网织红细胞模拟物的制备方法，其特征在于，用稀释液稀释纯化红细胞至1012-1014个/L。4.根据权利要求1所述的网...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹凤，蔡清华，刘旭，林月，孙成艳，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22