一种利用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体的方法。本发明专利技术提供了一种从生物样品中分离外泌体的方法，是采用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体。所述DEAE磁纳米颗粒的粒径为200‑30000nm。所述方法包括如下步骤：(1)采用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中捕获外泌体；(2)采用洗脱液分离DEAE磁纳米颗粒上的外泌体。本发明专利技术提供的方法可以实现高效率地分离高纯度的外泌体，然后对捕获的外泌体进行蛋白和核酸分析，进一步应用与生物检测或医疗检验中。

【技术实现步骤摘要】
一种利用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体的方法。
技术介绍
外泌体是一种细胞分泌至细胞外的直径在30-150nm的膜性囊泡。细胞通过内吞作用将胞外的物质摄入胞内形成小囊泡，随后，小囊泡发生融合形成早期核内体并进一步演变为晚期核内体。细胞质内的一些蛋白和miRNA进入晚期核内体进而演变成多泡体。小囊泡被释放到胞外从而形成外泌体。细胞培养基以及体液(血浆、血清、尿液、唾液等)中都有外泌体的存在。外泌体的外膜为磷脂双分子层，并含有一些功能蛋白。外泌体内含有蛋白质、脂类、mRNA、miRNA等。根据文献报道，外泌体广泛参与细胞通讯、免疫应答、肿瘤转移等过程。肿瘤分泌的外泌体含有肿瘤特异性的蛋白、microRNA、长链非编码RNA，因此可以通过检测肿瘤分泌的外泌体来实现癌症的早期诊断。想要外泌体的快速、高效的提取分离是外泌体研究的基础。现有的外泌体分离提取方法主要有超高速离心，免疫法，超滤法，商业化试剂盒，色谱排阻等。超高速离心先通过差速离心除去细胞及碎片，然后超高速离心(16000rpm)富集外泌体。超高速离心法一般需要6-8小时，回收率比较低，只有5-25％，费用昂贵。免疫法主要是利用抗体修饰的磁珠来捕获外泌体，得到的外泌体高纯度，回收率高。但普适性低，只捕获含有目标蛋白的外泌体，容易造成失真的分析。超滤法是利用抽真空的方法使含外泌体的溶液通过微滤膜，从而把外泌体富集在微滤膜上，这种方法富集效率比较高，但是易于堵塞，而且外泌体会受到压力损伤。现已有一些商业化的试剂盒(比如ExoQuick，TotalExosomeIsolation)来提取外泌体，使用方便，但需要过夜操作，且操作环境开放，可能会有化学试剂残留影响后续qPCR、测序等操作。许多这些常规的外泌体分离技术都具有一定的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体的方法。本专利技术提供了一种从生物样品中分离外泌体的方法，是采用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体。所述DEAE磁纳米颗粒的粒径为200-30000nm。所述DEAE磁纳米颗粒的粒径具体可为200nm。所述方法包括如下步骤：(1)采用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中捕获外泌体；(2)采用洗脱液分离DEAE磁纳米颗粒上的外泌体；所述洗脱液为盐溶液，和/或，所述洗脱液的pH值为6-9。所述洗脱液为含有100-500mMNaCl和50mMHEPES的水溶液。所述洗脱液具体可为含有200mMNaCl和50mMHEPES的水溶液。所述洗脱液的pH具体可为7.2。所述步骤(1)中，DEAE磁纳米颗粒的浓度为0.5-3mg/mL，和/或，DEAE磁纳米颗粒与生物样品的孵育时间为5-30min。所述步骤(1)中，DEAE磁纳米颗粒的浓度具体为5mg/mL，和/或，DEAE磁纳米颗粒与生物样品的孵育时间具体为10min。所述洗脱液和磁纳米颗粒的孵育时间为1min。所述步骤(1)后，还包括使用清洗液清洗杂质的步骤；所述清洗液为含有25-50mMNaCl和50mMHEPES的水溶液。所述清洗液的pH为6.2。当所述生物样品为血浆时，所述清洗液具体可为含有50mMNaCl和50mMHEPES的水溶液。当所述生物样品为尿液时，所述清洗液具体可为含有25mMNaCl和50mMHEPES的水溶液。所述步骤(1)前，还包括使用平衡液平衡DEAE磁纳米颗粒的步骤；所述平衡液为含有25mMNaCl和50mMHEPES的水溶液。所述平衡液的pH为6.2。所述平衡时间为2min。本专利技术还保护DEAE磁纳米颗粒在分离外泌体中的应用。本专利技术还保护一种用于分离外泌体的试剂盒，包括DEAE磁纳米颗粒和以上任一所述的洗脱液。所述试剂盒还包括以上任一所述的清洗液。所述试剂盒还包括以上任一所述的平衡液。本专利技术还保护以上任一所述方法在生物检测或医疗检验中的应用。以上任一所述DEAE磁纳米颗粒为表面包裹有DEAE的磁纳米颗粒。所述DEAE磁纳米颗粒具体可为由金属氧化物组成的磁性内核及包裹在磁性内核外的高分子聚合物(DEAE-纤维素)组成的磁纳米颗粒。所述金属氧化物具体可为磁性氧化铁。所述DEAE磁纳米颗粒更具体可为Chemicell公司的fluidMAG-DEAE。以上任一所述生物样品可为细胞培养基、血液、血浆、尿液、牛奶、唾液、乳汁等。本专利技术首次提出了一种利用二乙氨乙基(DEAE)磁纳米颗粒从生物样品中实现外泌体分离的方法。首先，用平衡液对DEAE磁纳米颗粒进行平衡，随后用合适浓度的DEAE磁纳米颗粒从生物样品中捕获外泌体，用梯度浓度的盐溶液进行洗脱，收集洗脱液，用NTA，检测不同浓度的盐溶液洗脱得到的外泌体浓度以及外泌体的纯度，筛选出最优的盐浓度，然后选用最优的盐浓度和pH来分离外泌体，从而实现高效率地分离高纯度的外泌体。DEAE磁纳米颗粒基于外泌体与蛋白核酸等带电性质的不同，用阴离子交换的方法在分离纯化外泌体。原则上，DEAE磁纳米颗粒可以捕获所有的外泌体。在本专利中，专利技术人利用DEAE磁纳米颗粒在30min内实现了高效地分离纯化外泌体，外泌体的回收率高达90％，高于现有的超速离心、免疫磁珠等方法，极大地缩减了外泌体分离的时间(超速离心需要6-8h，免疫磁珠法需要3h以上)。由于DEAE磁纳米颗粒法不含会破坏外泌体的试剂，因此分离得到的外泌体完整性很好。另外，DEAE磁纳米颗粒法的通用性很好，不仅可以用于从血浆中分离外泌体，还可以用于从尿液、细胞培养基中分离外泌体，为外泌体的快速分离检测提供了很好的工具。附图说明图1为利用DEAE磁纳米颗粒从血浆中分离外泌体的流程图。图2为外泌体鉴定结果。A：TEM观察DEAE磁纳米颗粒分离的外泌体的形态；B:NTA测DEAE磁纳米颗粒分离的外泌体的粒径分布。图3为外泌体洗脱效率及蛋白总量统计结果。图4为外泌体中的CD81浓度统计结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。二乙氨乙基(DEAE)磁纳米颗粒：Chemicell公司，fluidMAG-DEAE，粒径：200nm；浓度：25mg/mL，保存在ddH2O中。实施例1、利用DEAE磁纳米颗粒从血浆中分离纯化外泌体本方法流程图见图1，具体如下：一、平衡DEAE磁纳米颗粒1、取100μLDEAE磁纳米颗粒漩涡振荡30s，使DEAE磁纳米颗粒充分重悬，得到磁纳米颗粒悬液。2、完成步骤1后，取100μL磁纳米颗粒悬液置于1mLEP管中，将EP管置于磁力架上，对磁纳米颗粒悬液进行磁性分离，弃上清液，加入25mMNaCl+50mMHEPES水溶液(pH＝6.2)重悬磁纳米颗粒，对DEAE磁纳米颗粒表面的正电荷进行平衡2min。3、完成步骤2后，用磁力架将DEAE磁纳米颗粒吸至EP管底，小心吸弃上清，收集磁纳米颗粒。二、血浆预处理取10mL离体的新鲜的全血，3000g、4℃离心10min，去除血细胞，小心取出上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从生物样品中分离外泌体的方法，是采用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种从生物样品中分离外泌体的方法，是采用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中分离外泌体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述DEAE磁纳米颗粒的粒径为200-30000nm。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)采用DEAE磁纳米颗粒从生物样品中捕获外泌体；(2)采用洗脱液分离DEAE磁纳米颗粒上的外泌体；所述洗脱液为盐溶液，和/或，所述洗脱液的pH值为6-9。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述洗脱液为含有100-500mMNaCl和50mMHEPES的水溶液。5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，DEAE磁纳米颗粒的浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈军歌，邢婉丽，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11