一种扩增MSF1基因的方法及试剂盒与应用技术

本发明专利技术涉及一种MSF1基因DNA扩增方法，以及通过分析MSF1基因的甲基化状态来辅助诊断宫颈癌的方法和试剂盒及其应用。

【技术实现步骤摘要】
一种扩增MSF1基因的方法及试剂盒与应用
本专利技术涉及一种MSF1基因DNA扩增方法，以及通过分析MSF1基因的甲基化状态来辅助诊断宫颈癌的方法和试剂盒及其应用。
技术介绍
已有研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的高危因素。通过观察细胞形态的宫颈液基薄层细胞检测(TCT)联合HPV检测是目前临床用于筛查宫颈癌的主要方法。TCT受人为干扰因素大，从取样-涂片-观察-判读都受人为因素的影响；而HPV感染多提示短暂性感染，对预测宫颈癌的发生价值相对较低。目前从肿瘤发生的分子机制入手来寻找肿瘤早诊的分子标志物已经成为一种趋势。基因启动子区域CpG岛甲基化能使基因表达沉默，从而引起一系列细胞的分子水平事件。目前国际已经公认基因甲基化是肿瘤发生进展过程中的早期事件。因此通过检测基因的甲基化对于预测细胞的癌变已经开始应用在不同的肿瘤早期诊断上，例如通过外周血中游离DNA的基因甲基化早诊大肠癌；通过分析肺泡灌洗液细胞中基因甲基化早诊肺癌，等等。但是，现有的检测甲基化的方法普遍存在位点特异性较差，干扰信号过高，反应灵敏度不够等问题，因此迫切需要一种能够高通量、高特异性、高灵敏度扩增目标基因位点的PCR扩增方法。
技术实现思路
本公开的一个目的是提供一种MSF1基因DNA扩增方法，所述方法包括：将待测标本、对照基因进行PCR反应，其中PCR反应中DNA标本是经过亚硫酸氢盐处理的、转化后的DNA标本，优选地，所述PCR扩增反应体系中包括3`端进行了去羟基化修饰的封闭探针。本公开的一个目的是提供一种MSF1基因DNA扩增方法，所述方法包括：将待测标本、对照基因进行荧光定量PCR反应，其中PCR反应中DNA标本是经过亚硫酸氢盐处理的、转化后的DNA标本，所述PCR扩增反应体系中包括3`端进行了去羟基化修饰的封闭探针。本专利技术的一个目的是通过分析宫颈癌患者以及非宫颈癌对照人群的宫颈组织中MSF1基因的启动子区域的甲基化程度存在明显差异，从而证明通过检测MSF1的甲基化可以作为辅助诊断宫颈癌的生物标志物。本公开的一个目的在于提供实现检测MSF1基因甲基化的方法试剂盒及其使用方法。本公开针对MSF1基因的第三种转录本的第1号外显子上的CpG岛的甲基化进行检测。在一方面，本公开涉及一种MSF1基因扩增方法，所述方法是基于PCR的方法，包括：(1)PCR引物设计；(2)样品DNA提取；(3)DNA的甲基化修饰转化；(4)PCR扩增。PCR扩增后的产物可以进行常规实验室分析，包括但不限于电泳分析，定量分析，相互作用分析，DNA片段提纯，测序分析等。在进一步的一方面，本公开涉及一种MSF1基因扩增方法，所述方法是基于荧光定量PCR的方法，包括：(1)PCR引物设计；(2)探针设计；(3)样品DNA提取；(4)DNA的甲基化修饰转化；(5)荧光定量PCR扩增。在一方面，任选地本公开的PCR引物包括检测MSF1基因的引物和对照基因引物，优选地所述对照基因是ActB基因。在一方面，任选地本公开的探针包括检测MSF1基因甲基化位点和对照基因的探针，优选地，还包括封闭MSF1基因非甲基化位点的探针。在一方面，任选地本公开的样品DNA是体外样本，包括血液、体液、组织样本等，任选地，所述样本来自于临床样本，优选地，所述样本是宫颈组织，和宫颈细胞刷片。在一方面，任选地本公开的样品DNA采用商业化试剂盒进行提取，例如天根生化科技(北京)有限公司的TIANampGenomicDNAkit(离心柱法)。在一方面，任选地本公开的DNA的甲基化修饰转化采用亚硫酸盐处理，优选采用6-8M的亚硫酸铵，60-80℃处理1-5个小时对DNA进行转化，最优选采用7.5M的亚硫酸铵，70℃处理2个小时对DNA进行转化。当然，本公开方法也可以选择亚硫酸氢盐转化试剂盒，包括QIAGEN、默克密理博、Sigma-Aldrich、Zymo、LifeTechnologies等。在一方面，任选地，本公开的DNA经过甲基化修饰转化后再进一步进行纯化，优选地，所述纯化采用磁珠分选法。在一方面，任选地本公开还包括计算扩增的MSF1基因甲基化的Ct值，和对照基因的Ct值。在一方面，本公开涉及诊断宫颈癌的方法，所述方法包括检测MSF1基因甲基化程度，然后根据事先确定的阈值判断宫颈癌的风险。任选地，所述MSF1基因甲基化程度可以体现为图形或者数值，任选地，所述图形如图1或2所示。在一方面，本公开涉及诊断宫颈癌的方法，所述方法包括对来自样本的荧光定量PCR扩增的结果进行分析处理，然后根据处理的结果判断宫颈癌的风险。在一方面，本公开涉及一种检测MSF1基因甲基化程度的试剂盒，所述试剂盒包括检测MSF1基因的引物，检测MSF1基因甲基化位点的探针，ActB基因对照引物和探针。在进一步的方面，任选地，本公开还包括封闭MSF1基因非甲基化位点的探针。在进一步的方面，任选地，本公开的探针末端是淬灭剂标记的，优选用不同的淬灭剂标记，更优选地，检测MSF1基因甲基化位点的探针在3’末端用Dabcyl标记，封闭MSF1基因非甲基化位点的探针在3’末端用C3标记，ActB基因的探针在3’末端用BHQ1标记，进一步优选地，检测MSF1基因甲基化位点的探针在5’端还用荧光染料标记。优选地，所述的封闭MSF1基因非甲基化位点的探针为寡核苷酸链，更优选地，所述的阻断片段的3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer中的一种或者多种。最优选地，所述阻断片段的序列为C3Spacer修饰。优选地，所述的MSF1基因和对照基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、TexasRed、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和对照基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。在一方面，本公开涉及一种检测MSF1基因甲基化程度的引物及其在制备用于诊断宫颈癌的试剂盒中的用途，所述引物序列为：MSF1-FGTGGATATTAAAAAGGAGTAGTAAGMSF1-RACAACCTCCTCTCTCCAC。在一方面，本公开涉及一种检测MSF1基因甲基化程度的探针及其在制备用于诊断宫颈癌的试剂盒中的用途，所述探针序列为：AAATAAAACGCGACGCATTAT，优选地，所述探针同时标记荧光染料和淬灭剂，更优选地，所述探针在5’标记荧光染料，在3’标记淬灭剂。在一方面，本公开涉及一种封闭MSF1基因非甲基化程度的探针及其在制备用于诊断宫颈癌的试剂盒中的用途，所述探针序列为：AAATAAAACACAACACATTATAACCC，优选地，所述探针在3’端标记淬灭剂。附图说明图1宫颈癌阳性样本的qPCR原始起峰图。长散点曲线表示对照基因ActB的起峰曲线；短散点曲线表示甲基化MSF1基因的起峰曲线。图2宫颈癌阴性样本的qPCR原始起峰图。长散点曲线表示对照基因ActB的起峰曲线；短散点曲线表示甲基化MSF1基因的起峰曲线。具体实施方式一种MSF1基因扩增方法，所述方法包括：将待测DNA进行PCR反应扩增，其中包括针对MSF1基因的第三种转录本的第1号外显子上的CpG岛的甲基化位点进行扩增。一种MSF1基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种MSF1基因扩增方法，所述方法包括：将待测DNA进行PCR反应，其中针对MSF1基因的第三种转录本的第1号外显子上的CpG岛的甲基化位点进行扩增。

【技术特征摘要】
1.一种MSF1基因扩增方法，所述方法包括：将待测DNA进行PCR反应，其中针对MSF1基因的第三种转录本的第1号外显子上的CpG岛的甲基化位点进行扩增。2.根据权利要求1的方法，其中PCR扩增后的产物可以进行进一步分析，优选地所述分析包括电泳分析，定量分析，相互作用分析，DNA片段提纯，测序分析等。3.一种MSF1基因扩增方法，其中所述方法是基于荧光定量PCR的方法，所述方法包括：(1)PCR引物设计；(2)探针设计；(3)样品DNA提取；(4)DNA的甲基化修饰转化；(5)荧光定量PCR扩增。4.一种扩增MSF1基因的试剂盒，所述试剂盒包括扩增MSF1基因的引物，结合MSF1基因甲基化位点的探针，ActB对照基因引物和探针。5.根据前述权利要求任一项的方法或试剂盒，所述扩增MSF1基因的引物序列为：MSF1-FGTGGATATTAAAAAGGAGTAGTAAGMSF1-RACAACCTCCTCTCTCCAC。6.根据前述权利要求任一项的方法或试剂盒，其中还包括扩增对照基因的引物，优选所述对照基因是ActB基因，更优...

【专利技术属性】
技术研发人员：李旭辉，张雷，郭书娟，
申请(专利权)人：敬善生物科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32