一种利用基因芯片检测α-倒捻子素引发的基因表达变化的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用基因芯片检测α‑倒捻子素对炎症细胞基因表达变化的方法，所述方法包括以下步骤：步骤一，IEC‑6细胞炎症模型的建立，步骤二、用LPS刺激后的IEC‑6细胞炎症模型测试中药。

【技术实现步骤摘要】
一种利用基因芯片检测α-倒捻子素引发的基因表达变化的方法
：本专利技术涉及药物筛选及其疗效检测方法，特别涉及用基因芯片检测脂多糖刺激IEC-6细胞表达谱变化的方法，从而检测脂多糖是否能够引发炎症反应，以及作为炎症模型用来测试药物对炎症模型的作用以及作用机制。
技术介绍
：中药是指以中医药理论为指导，有着独特的理论体系和应用形式，用于预防和治疗疾病并具有康复与保健作用的天然药物及其加工代用品，主要包括植物药、动物药、矿物药。中药的治疗作用长期以来是以服用后的症状变化为依据确定的，这种方法对于新的适应症显然不适用，为研究中药的新的疗效和作用机制，采用新技术势在必行。IEC-6细胞：是大鼠正常小肠粘膜上皮细胞，可以用于营养学和抗炎药物的研究。脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，脂多糖对宿主是有毒性的。脂多糖只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。其毒性成分主要为类脂质A。内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的粘肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。内毒素耐热而稳定，抗原性弱。脂多糖具有以下特性：①脂质和多糖的复合物；②为革兰氏阴性细菌外璧层中特有的一种化学成分，分子量大于10000，结构复杂，在不同类群、甚至菌株之间都有差异。以沙门氏菌为例，其脂多糖由核心多糖、O-多糖侧链、和类脂A组成。为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，脂多糖是内毒素和重要群特异性抗原(O抗原)。脂多糖由三部分组成:类脂A、核心多糖、O-抗原。脂质A(LipidA)为构成内毒素活性的糖脂，以共价键联结到杂多糖链，有两部分:一是核心多糖，在有关的菌株内是恒定的；另一O特异性链(O-specificchain)是高度可变的。大肠杆菌的脂多糖在实验室免疫学中是常用的B细胞促分裂因子即多克隆活化因子(polyclonalactivator)。脂多糖为含糖和脂质的化合物,在组成上糖的分量多于脂,故名。革兰氏阴性细菌外膜的一种主要成分。其脂酰链嵌入于细菌的外膜，其糖链暴露于细菌的表面，并具有抗原性(通常称为O抗原)。脂多糖也是细菌内毒素的主要成分。当革兰氏阴性细菌崩裂时释出，是很强的发热原。其单糖组成较特殊，包括D-葡萄糖D-半乳糖及D-甘露糖的3，6位脱氧衍生物及一些辛醛糖。外膜蛋白嵌合在LPS和磷脂层外膜上。结构上，它们都具有β-桶状结构，不同的外膜蛋白的β-桶由不同偶数个β-折叠片组成，从8个到22个不等；功能上，它们具有为外膜提供通透性，维持外膜结构稳定的作用。折叠好的外膜蛋白具有极强的稳定性，常温下，在2％的强离子型表面活性剂SDS中，外膜蛋白仍然具有正常的折叠结构；而在此温度下，其他可溶蛋白在0.2％的SDS中就可以迅速失去结构。因此通常将加样前是否对样品进行95C加热去折叠的SDS-PAGE称为denaturedSDS-PAGE和semi-nativeSDS-PAGE，并被用来研究外膜蛋白的折叠状况。基因芯片(genechip)是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，可以快速得到所测DNA碎片的基因序列。比如在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中含有带有荧光标记的核酸序列时，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因芯片可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。本专利技术采用基因芯片技术，找到一种检测方法，使用该方法，可以观察使用脂多糖刺激IEC-6细胞基因表达谱的变化，从而判断IEC-6细胞可能的炎症发生机理，从而为中药治疗IEC-6细胞炎症提供模型和依据。
技术实现思路
本专利技术提供一种采用基因芯片技术检测IEC-6细胞基因表达谱的变化的方法，所述方法包括以下步骤：步骤一，IEC-6细胞炎症模型的建立，方法如下：1)，IEC-6细胞培养；2)，脂多糖刺激建立IEC-6细胞炎症模型；3)，分离提取LPS刺激后的IEC-6细胞总RNA；4)，总RNA反转录成cDNA，再转化为cRNA，纯化cRNA；5)，用基因芯片检测脂多糖刺激后的IEC-6细胞基因变化cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；根据结果判断加入脂多糖的样品和不加脂多糖的样品之间的表达变化；步骤二、用脂多糖刺激后的IEC-6细胞炎症模型测试中药，方法如下：1)，IEC-6细胞的培养，分离，纯化；2)，脂多糖刺激IEC-6细胞；3)，加入中药；4)，提取加入中药的脂多糖刺激后的IEC-6细胞的总RNA；5)，总RNA反转录成cDNA，再转化为cRNA，纯化cRNA；6)，基因芯片检测IEC-6细胞炎症细胞基因变化cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；7)，根据检测结果判断加入中药的的样品和不加中药的样品之间的表达变化。其中，所述中药为α-倒捻子素。本专利技术进一步提供用LPS刺激后的IEC-6细胞炎症模型测试α-倒捻子素，方法如下：1)，IEC-6细胞培养培养IEC-6细胞，当IEC-6细胞融合率达90％以上时，行细胞传代；2)，建立IEC-6细胞炎症模型加入脂多糖刺激IEC-6细胞，得到炎症模型；3)，向脂多糖刺激后IEC-6细胞中加入α-倒捻子素向脂多糖刺激后IEC-6细胞中加入α-倒捻子素；4)，对加入α-倒捻子素的细胞提取总RNA加入试剂，使细胞完全裂解，经离心得到RNA；5)，cRNA样品的制备纯化总RNA，合成cDNA，将cDNA转化为aaUTP标记的cRNA，纯化cRNA；6)，检测cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；7)，根据检测结果判断加入α-倒捻子素的样品和不加α-倒捻子素的样品之间的表达变化。其中，所述1)，IEC-6细胞培养，步骤如下：细胞培养瓶中培养IEC-6细胞，当IEC-6细胞融合率达90％以上时，用0.25％含EDTA胰酶进行消化处理，随后加入含酚红DMEM完全培养液终止胰酶消化作用，将含细胞培养液移至15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃去培养基，加入含酚红DMEM完全培养液，进行细胞传代。其中，所述2)，建立IEC-6细胞炎症模型，步骤如下：用5-15μg/ml的脂多糖刺激IEC-6细胞12-36小时作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用基因芯片技术检测IEC‑6细胞基因表达谱的变化的方法，所述方法包括以下步骤：步骤一，IEC‑6细胞炎症模型的建立，方法如下：1)，IEC‑6细胞培养；2)，脂多糖刺激建立IEC‑6细胞炎症模型；3)，分离提取LPS刺激后的IEC‑6细胞总RNA；4)，总RNA反转录成cDNA，再转化为cRNA，纯化cRNA；5)，用基因芯片检测脂多糖刺激后的IEC‑6细胞基因变化cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；根据结果判断加入脂多糖的样品和不加脂多糖的样品之间的表达变化；步骤二、用脂多糖刺激后的IEC‑6细胞炎症模型测试中药，方法如下：1)，IEC‑6细胞的培养，分离，纯化；2)，脂多糖刺激IEC‑6细胞；3)，加入中药；4)，提取加入中药的脂多糖刺激后的IEC‑6细胞的总RNA；5)，总RNA反转录成cDNA，再转化为cRNA，纯化cRNA；6)，基因芯片检测IEC‑6细胞炎症细胞基因变化cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；7)，根据检测结果判断加入中药的的样品和不加中药的样品之间的表达变化。

【技术特征摘要】
1.一种采用基因芯片技术检测IEC-6细胞基因表达谱的变化的方法，所述方法包括以下步骤：步骤一，IEC-6细胞炎症模型的建立，方法如下：1)，IEC-6细胞培养；2)，脂多糖刺激建立IEC-6细胞炎症模型；3)，分离提取LPS刺激后的IEC-6细胞总RNA；4)，总RNA反转录成cDNA，再转化为cRNA，纯化cRNA；5)，用基因芯片检测脂多糖刺激后的IEC-6细胞基因变化cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；根据结果判断加入脂多糖的样品和不加脂多糖的样品之间的表达变化；步骤二、用脂多糖刺激后的IEC-6细胞炎症模型测试中药，方法如下：1)，IEC-6细胞的培养，分离，纯化；2)，脂多糖刺激IEC-6细胞；3)，加入中药；4)，提取加入中药的脂多糖刺激后的IEC-6细胞的总RNA；5)，总RNA反转录成cDNA，再转化为cRNA，纯化cRNA；6)，基因芯片检测IEC-6细胞炎症细胞基因变化cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；7)，根据检测结果判断加入中药的的样品和不加中药的样品之间的表达变化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中药为α-倒捻子素。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二、用LPS刺激后的IEC-6细胞炎症模型测试中药，方法如下：1)，IEC-6细胞培养培养IEC-6细胞，当IEC-6细胞融合率达90％以上时，行细胞传代；2)，建立IEC-6细胞炎症模型加入脂多糖刺激IEC-6细胞，得到炎症模型；3)，向脂多糖刺激后IEC-6细胞中加入α-倒捻子素向脂多糖刺激后IEC-6细胞中加入α-倒捻子素；4)，对加入α-倒捻子素的细胞提取总RNA加入试剂，使细胞完全裂解，经离心得到RNA；5)，cRNA样品的制备纯化总RNA，合成cDNA，将cDNA转化为aaUTP标记的cRNA，纯化cRNA；6)，检测cRNA样品和芯片杂交，然后取出芯片，洗涤后在扫描仪中扫描；7)，根据检测结果判断加入α-倒捻子素的样品和不加α-倒捻子素的样品之间的表达变化。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，所述1)，IEC-6细胞培养，步骤如下：细胞培养瓶中培养IEC-6细胞，当IEC-6细胞融合率达90％以上时，用0.25％含EDTA胰酶进行消化处理，随后加入含酚红DMEM完全培养液终止胰酶消化作用，将含细胞培养液移至15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃去培养基，加入含酚红DMEM完全培养液，进行细胞传代。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，所述2)，建立I...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹朋，邹闻书，史雅然，刘凤华，李焕荣，侯晓林，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11