斑茅野生种受干旱胁迫表达的基因SaWRKY制造技术

本发明专利技术公开了斑茅野生种受干旱胁迫表达的基因SaWRKY，以及扩增该基因的专用引物和用相对定量RT‑PCR技术检测该基因在斑茅野生种中受干旱胁迫的差异表达方法。本发明专利技术为甘蔗抗旱性育种提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
斑茅野生种受干旱胁迫表达的基因SaWRKY
本专利技术属分子生物学
，具体涉及干旱胁迫下的WRKY转录因子基因SaWRKY，以及扩增该基因的专用引物，通过相对定量RT-PCR技术检测该蛋白基因在斑茅野生种中差异表达的方法。
技术介绍
斑茅(Erianthusarundinaceus(Retz.)Jeswiet)是甘蔗近缘野生种之一，又名大密、笆茅、大巴茅，多年生、密丛高大草本，具有分布区域广、耐干旱、耐贫瘠、分蘖能力强等优良特性，是甘蔗育种中拥有较大利用价值的材料。育种工作的成败在很大程度上取决于对育种原始材料的占有量和研究利用的广度及深度，因此，斑茅野生种质资源的收集工作深受甘蔗育种专家的重视。近年来，能源植物的研究成为全球范围内的热点，斑茅因产量高、生长快、抗逆性强、能效高以及生产成本低，符合作为能源草的特征，有研究表明斑茅有作为能源草的潜力。因此，开发利用斑茅资源，挖掘斑茅的抗旱基因，培育优异种质特性是解决当前斑茅利用和甘蔗新种质创新中所遇到问题的最佳途径，为甘蔗抗旱育种提供科学依据有着重要意义(陈健文,PhillipA.Jackson,劳方业,刘睿,陈勇生,邓海华.应用ISSR标记鉴定斑茅BC2杂种真实性[J].中国糖料,2008(01):1-3.)。WRKY转录因子家族是植物中特有的一种转录因子，也是植物中最大的转录调控因子家族之一，其中WRKY结构域是WRKY转录因子最突出的一个特点，这是一个在家族成员中高度保守的60个氨基酸的区域，其靠近氨基(N)末端有7个保守的氨基酸残基WRKYGQK。它参与调控植物的多种进程：植物病理反应过程、生物胁迫过程、非生物胁迫过程、生长发育过程和激素合成过程。在植物病理过程中，WRKY转录因子主要参与ja和sa的信号途径激活植物的抗病性，目前在水稻、拟南芥、油菜等作物中均发现WRKY基因在病原真菌和激素处理(ABA、JA、SA、ET、细胞分裂素的一种或多种)反应应答。(Eulgem,Thomas,Rushton,etal.TheWRKYsuperfamilyofplanttranscriptionfactors[J].TrendsinPlantScience,2000,5(5):199-206.文锋,吴小祝,廖亮,等.WRKY转录因子在植物抗逆生理中的研究进展[J].广西植物,2017,37(1):69-79.)。目前在甘蔗研究上，尤其关于斑茅野生种抗旱有关的WRKY基因未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的是为了提高现有栽培甘蔗品种的抗逆性，使甘蔗在干旱逆境中能高产稳产从而适应近年来气候恶化的情况，提供一个新的斑茅野生种中受干旱胁迫诱导的WRKY转录因子基因，还提供一种扩增该基因的专用引物，以及一种检测该基因在斑茅野生种受干旱胁迫的差异表达的方法，从而进一步为甘蔗抗旱性育种奠定基础并提供候选基因。本专利技术从受干旱胁迫的斑茅野生种中利用同源克隆技术克隆获得一个WRKY转录因子基因SaWRKY，在NCBI数据库中比对分析，与禾本科高粱WRKY基因的同源性为75％，推测该基因编码蛋白为WRKY转录因子，故将该基因命名为基因SaWRKY。本专利技术的技术方案如下：1.斑茅野生种受干旱胁迫表达的基因SaWRKY，其全长核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.扩增技术方案1所述的斑茅野生种受干旱胁迫表达的基因SaWRKY的专用引物，所述专用引物由上游引物GP-F和下游引物GP-R组成，所述上游引物GP-F的碱基序列如SEQIDNO：2所示，所述下游引物GP-R的碱基序列如SEQIDNO：3所示。3.一种检测基因SaWRKY在斑茅野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，包括干旱胁迫处理、总RNA的提取、cDNA第一链的合成、相对定量RT-PCR技术检测基因SaWRKY在斑茅野生种中受干旱胁迫的差异表达情况，其特征在于：在相对定量RT-PCR技术检测基因SaWRKY在斑茅野生种中受干旱胁迫的差异表达情况中，使用的特异引物由上游引物QF和下游引物QR组成，所述上游引物QF碱基序列如SEQIDNO:4所示，所述下游引物QR的碱基序列如SEQIDNO:5所示；所述基因SaWRKY的全长核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。4.根据技术方案3所述的一种检测基因SaWRKY在斑茅野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，其特征在于：在相对定量RT-PCR技术检测基因SaWRKY在斑茅野生种中受干旱胁迫的差异表达情况中，相对定量RT-PCR反应体系为：2×SuperRealPreMixPlus10μl，10μM上游引物QF0.6μl，10μM下游引物QR0.6μl，cDNA模板1μl，50×ROXReferenceDye0.6μl，RNase-freeddH2O12.2μl，总体积25μl；相对定量RT-PCR反应程序：95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环。5.根据技术方案3或4所述的一种检测基因SaWRKY在斑茅野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，其特征在于：在干旱胁迫处理中将伸长期的斑茅野生种设为对照组和处理组，对照组按常规供水，处理组干旱胁迫8d，所述干旱胁迫8d为连续8d不浇水。本专利技术首次提出了斑茅野生种受低温干旱胁迫表达的基因SaWRKY，以及扩增它的专用引物、检测该基因在斑茅野生种中受干旱胁迫中差异表达的特异引物和方法。在检测中该基因在没有干旱胁迫的情况下在斑茅中少量表达，在经过干旱胁迫处理后在斑茅野生种中的表达量为对照的数倍，说明该基因在斑茅野生种受到干旱胁迫后表达量上升，且抗旱性强的斑茅野生种表达量处理前后均高于抗旱性较弱的斑茅野生种，说明所述基因SaWRKY属于受干旱胁迫表达的诱导型表达基因，表明基因SaWRKY在斑茅野生种受到干旱胁迫后能迅速的参与干旱胁迫响应过程，该基因通过表达量的上调从而调控斑茅野生种的抗旱机制。本专利技术为认识斑茅WRKY基因的抗逆机制，以及利用斑茅野生种进行分子育种提供了技术支撑和候选基因。本专利技术检测基因SaWRKY在斑茅野生种受干旱胁迫的差异表达的方法，所设计的特异引物在相对定量RT-PCR中特异性强，无杂带产生，熔解曲线显示无引物二聚体产生。在内参基因的选择上，主要以25SrRNA，ACTIN两内参，而本试验选择最合适甘蔗的内参25SrRNA，其稳定性更高。本相对定量RT-PCR采用SYBRGreenI嵌合荧光法进行，具有特异性强，灵敏度高，重复性好等特点。序列表中SEQIDNO:1所示的是基因SaWRKY的全长核苷酸序列。序列表中SEQIDNO:2所示的是扩增基因SaWRKY的上游引物GP-F的碱基序列。序列表中SEQIDNO:3所示的是扩增基因SaWRKY的下游引物GP-R的碱基序列。序列表中SEQIDNO:4所示的是特异引物的上游引物QF的碱基序列。序列表中SEQIDNO:5所示的是特异引物的下游引物QR的碱基序列。序列表中SEQIDNO:6所示的是内参基因25SrRNA的上游引物25S-F的碱基序列。序列表中SEQIDNO:7所示的是内参基因25SrRNA的下游引物25S-R的碱基序列。附图说明图1：基因SaWRKY的扩增结果。图1中，M：maker；泳道1、泳道2、泳道3分别为退火温度57℃、58℃、60℃下的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.斑茅野生种受干旱胁迫表达的基因SaWRKY，其全长核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.斑茅野生种受干旱胁迫表达的基因SaWRKY，其全长核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.扩增权利要求1所述的斑茅野生种受干旱胁迫表达的基因SaWRKY的专用引物，所述专用引物由上游引物GP-F和下游引物GP-R组成，所述上游引物GP-F的碱基序列如SEQIDNO：2所示，所述下游引物GP-R的碱基序列如SEQIDNO：3所示。3.一种检测基因SaWRKY在斑茅野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，包括干旱胁迫处理、总RNA的提取、cDNA第一链的合成、相对定量RT-PCR技术检测基因SaWRKY在斑茅野生种中受干旱胁迫的差异表达情况，其特征在于：在相对定量RT-PCR技术检测基因SaWRKY在斑茅野生种中受干旱胁迫的差异表达情况中，使用的特异引物由上游引物QF和下游引物QR组成，所述上游引物QF碱基序列如SEQIDNO:4所示，所述下游引物QR的碱基序列如SEQIDNO:5所示；所述基因SaWRKY的全长核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：李富生，肖芙荣，何丽莲，曹哲群，陈疏影，徐荣，王先宏，孟玉，刘鲁峰，狄义宁，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南,53