【技术实现步骤摘要】
一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法
本专利技术属于紫花苜蓿生物技术育种领域，具体涉及一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法。
技术介绍
紫花苜蓿(MedicagosativaL.),是一种栽培历史悠久的多年生优质豆科牧草，具有适应性强、营养价值高、种植区域广、生态功能齐全、经济效益高等特点。它是多年生豆科牧草，是世界上种植面积最大的牧草品种，素有“牧草之王”的美誉。紫花苜蓿在我国已有两千多年的栽培历史，目前，我国紫花苜蓿种植的留床面积约146.7万多公顷。目前生产水平：干草产量平均13-17t/hm2，种子产量平均为375-600kg/hm2。所以说，中国的草产业主要是紫花苜蓿的产业化，其在农业和畜牧业发展中具有十分重要的价值和地位。培育产草量和蛋白质含量高的品种，对促进我国牧草优质生产和畜牧业发展具有重要意义。紫花苜蓿的蛋白质含量主要集中于叶片中，且叶片性状与产量性状相关。紫花苜蓿的叶子一般为三出羽状复叶，检测数据显示：紫花苜蓿60-70％的粗蛋白质和90％的维生素存在于叶片中，因此优质苜蓿应该是多叶的。由...
【技术保护点】
1.一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤(1)在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区设计靶序列；其中，所述靶序列的双链结构中的一条链具有NGG结构，其中N代表碱基A、T、C、G中的任意一种；步骤(2)按照靶序列的核苷酸排列顺序，构建用于紫花苜蓿MsPALM1基因打靶的由根癌农杆菌介导转化的双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1，所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1包含sgRNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述sgRNA表达框包含所述MsPALM1靶标片段；步骤(3...
【技术特征摘要】
1.一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤(1)在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区设计靶序列；其中，所述靶序列的双链结构中的一条链具有NGG结构，其中N代表碱基A、T、C、G中的任意一种；步骤(2)按照靶序列的核苷酸排列顺序，构建用于紫花苜蓿MsPALM1基因打靶的由根癌农杆菌介导转化的双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1，所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1包含sgRNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述sgRNA表达框包含所述MsPALM1靶标片段；步骤(3)将所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1通过根癌农杆菌转化导入紫花苜蓿细胞，使所述sgRNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在紫花苜蓿细胞中共同表达，剪切MsPALM1基因的双链的所述靶标片段，诱发所述紫花苜蓿细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内MsPALM1基因的功能缺失突变；步骤(4)，用步骤3中所述的紫花苜蓿细胞再生植株；步骤(5)，将步骤4中所得的再生植株中MsPALM1基因包含靶标片段的DNA区段进行PCR扩增后，使用限制性内切酶酶切检测和/或靶点深度测序检测；步骤(6)，选择四个等位基因都出现功能缺失突变的再生植株，进行表型鉴定，观察所述再生植株的复叶表型，挑取所有复叶完全表现多于3个小叶的植株，作为所创制的多叶型紫花苜蓿材料。2.根据权利要求1所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有5’-G(N)x-NGG-3’结构，其中(N)x表示数目为x的一条碱基序列{N1,N2······Nx},N1,N2······Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个。3.根据权利要求1所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述sgRNA表达框能够在紫花苜蓿细胞内表达并且核...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈海涛，王文，谢雄平，邱强，尚占环，苏克先，何辉，
申请(专利权)人：广东三杰牧草生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。