翅发育相关基因optomotor-blind的dsRNA及其在害虫防治中的应用制造技术

本发明专利技术公开了翅发育相关基因optomotor blind的dsRNA及其在害虫防治中的应用。本发明专利技术首次对橘小实蝇翅发育基因optomotor blind设计引物并合成了dsRNA，且运用饲喂法对橘小实蝇optomotor blind基因进行RNAi，在保证干扰效率的前提下得到翅发育畸形的表型。本发明专利技术不仅解决了注射导入dsRNA在田间难以操作的问题，为今后研究直接喷施的RNA制剂来防控橘小实蝇打下基础，也对有效防控橘小实蝇的入侵和扩散，保护我国农业生产、生态安全以及人类健康具有良好的经济、社会效益。

【技术实现步骤摘要】
翅发育相关基因optomotor-blind的dsRNA及其在害虫防治中的应用
本专利技术涉及生物技术及农业害虫防治领域，具体涉及翅发育相关基因optomotorblind(omb)的dsRNA及其在害虫防治中的应用，特别涉及在橘小实蝇防治中的应用。
技术介绍
橘小实蝇(BactroceradorsalisHendel)隶属于双翅目(Diptera)、实蝇科(Tephritidae)、果实蝇属(Bactrocera)，是多种热带、亚热带水果和蔬菜的重要害虫，近年来在我国北扩形势严峻。橘小实蝇为杂食性害虫，寄主范围广，可危害柑桔、番石榴、杨桃、芒果、香蕉、茄子、辣椒、瓜类等40多科250多种水果和蔬菜(邓志声，2001；商鸿生，1997)，2014年我国农业部将其列为农业重点防控入侵对象，橘小实蝇的防控策略受到普遍关注。目前，国内外普遍采用套袋、性诱及施用化学农药等措施控制重要经济实蝇的田间危害，但这些方法有一定的局限性，难以实现高效治理。近年来，基于遗传控制的橘小实蝇雄虫不育技术(SIT)为防治重要经济实蝇开辟了一条新途径，得到一定发展，但这种方法也因其工作量大且需要连续释放不育雄虫而受到限制。因此，探索更为简便和可持续的控制方法，实现绿色、高效的橘小实蝇田间治理尤为重要。昆虫翅的形成利于其迁移并扩大生活范围，橘小实蝇也因此扩散危害，对橘小实蝇翅发育相关基因的研究可以帮助从遗传学角度研究橘小实蝇的防治方法。随着对果蝇等模式昆虫的深入研究，与翅发育有关的信号通路逐渐被揭示，这些信号通路基因参与调控翅的发育，对于探索非模式昆虫翅发育机理提供参考意义。幼虫时期的翅称为翅芽，果蝇翅芽划分为前(anterior，A)、后(posterior，P)、背(dorsal，D)、腹(ventral，V)4个隔间(Bryant，1970；Garcia-Bellido&Merriam，1971b；Garcia-Bellidoetal.，1973)，分别由A/P隔间边界和D/V隔间边界隔开，边界线处细胞形成A/P和D/V组织中心，指导翅在2个轴向上的发育(Klein，2001)。Optomotorblind(简称omb)是Dpp信号通路的下游靶标基因，对维持前后隔间边界起到关键作用，在omb突变背景下前隔间的细胞会越过A/P边界到达后隔间，但不与后隔间细胞混合(Shen&Dahmann，2005b)。在后隔间抑制omb，翅芽上会出现一条A/P沟，在成虫翅中表现为在翅中间形成巨大缺刻，而在前隔间抑制omb并不能产生这样的沟(Shenetal.，2008)。双链RNA(dsRNA)介导的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)通过特异性降解靶标mRNA实现抑制特定基因表达的目的。随着生物技术的发展，RNAi已经在探索基因功能、基因治疗等方面显示出了巨大潜力，通过对农业害虫进行基因控制使其在昆虫学领域被广泛应用(Jaubert-Possamaietal.，2007；Price&Gatehouse，2008)。RNA干扰最早应用于果蝇并得以发展，相关学者利用RNA干扰技术研究果蝇的交配行为，发现体内缺少Genderblind蛋白的雄虫无法正确选择配偶(Grosjeanetal.,2007)。目前，应用RNAi技术证明了对淡色库蚊(Culexpipiens)的胰岛素基因进行沉默，可激活体内FOXO(forkheadtranscriptionfactor)的下游靶标基因，从而导致滞育(Sim&Denlinger,2008)。在赤拟谷盗中用RNAi抑制ubx和abd-A两个基因的表达，在中胸至第8腹节的10个体节均出现了鞘翅盘(Tomoyasuetal.，2005)，对赤拟谷盗晚期幼虫显微注射wg基因的dsRNA后，成虫翅宽度减小，翅间距增大，且羽化过程受到严重影响。赤拟谷盗是具有高效RNAi机制的昆虫，对赤拟谷盗任何虫态进行RNA干扰，都可使目的基因的表达受到抑制，且抑制效应还可以持续到下一代(李承军等，2011)。人工合成的dsRNA作为一种RNA制剂在未来害虫防治中具有广阔的发展和应用前景。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种dsRNA。本专利技术提供的dsRNA为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。本专利技术的第二个目的是提供编码上述dsRNA的DNA分子。本专利技术提供的编码上述dsRNA的DNA分子的核苷酸序列具体为序列表中序列2。本专利技术的第三个目的是提供含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。本专利技术的第四个目的是提供上述dsRNA或上述DNA分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系的新用途。本专利技术提供了上述dsRNA或上述DNA分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下a1)-a8)中任一种中的应用：a1)防治橘小实蝇；a2)制备防治橘小实蝇的产品；a3)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；a4)制备防控橘小实蝇的入侵和/或扩散的产品；a5)抑制橘小实蝇翅发育；a6)制备抑制橘小实蝇翅发育的产品；a7)抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达；a8)制备抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达的产品。本专利技术的第五个目的是提供一种抑制橘小实蝇翅发育的方法。本专利技术提供的抑制橘小实蝇翅发育的方法是将抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达的物质导入橘小实蝇，从而实现抑制橘小实蝇翅发育。上述方法中，所述抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达的物质为上述dsRNA。上述方法中，所述导入的方式为饲喂。所述饲喂的方法具体可为将dsRNA与纳米载体和饲料混匀，得到混合物，将所述混合物饲喂橘小实蝇。所述dsRNA、纳米载体和饲料的配比为1μg：(1-1.5)μL：(0.05-0.1)g，具体地，所述dsRNA、纳米载体和饲料的配比为1μg：1.4μL：0.075g。上述方法中，所述橘小实蝇可为1龄橘小实蝇幼虫。本专利技术的第六个目的是提供上述方法的新用途。本专利技术提供了上述方法在如下b1)-b3)中任一种中的应用：b1)防治橘小实蝇；b2)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；b3)抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达。本专利技术的第七个目的是提供一种产品。本专利技术提供的产品的活性成分为如下c1)或c2)：c1)上述dsRNA；c2)上述DNA分子；所述产品具有如下d1)-d4)中任一种功能：d1)防治橘小实蝇；d2)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；d3)抑制橘小实蝇翅发育；d4)抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达。本专利技术的第八个目的是提供抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达的物质。本专利技术提供的抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达的物质为如下e1)-e3)中任一种：e1)上述dsRNA；e2)上述DNA分子；e3)含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。本专利技术首次对橘小实蝇翅发育相关基因optomotorblind设计引物并合成了dsRNA，且运用饲喂法对optomotorblind基因进行RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。

【技术特征摘要】
1.一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。2.编码权利要求1所述dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列2。3.含有权利要求2所述的DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。4.权利要求1所述的dsRNA或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下a1)-a8)中任一种中的应用：a1)防治橘小实蝇；a2)制备防治橘小实蝇的产品；a3)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；a4)制备防控橘小实蝇的入侵和/或扩散的产品；a5)抑制橘小实蝇翅发育；a6)制备抑制橘小实蝇翅发育的产品；a7)抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达；a8)制备抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达的产品。5.一种抑制橘小实蝇翅发育的方法，是将抑制橘小实蝇翅发育基因optomotorblind表达的物质导入橘小实蝇，从而实现抑制橘小实蝇翅发育。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志红，郭韶堃，沈杰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11