一种基于缺电子苯甲醛的无催化剂腙连接多肽或蛋白质化学修饰方法技术

本发明专利技术提供了一种无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法，所述方法包括下述步骤：

【技术实现步骤摘要】
一种基于缺电子苯甲醛的无催化剂腙连接多肽或蛋白质化学修饰方法
本专利技术属于多肽和/或蛋白质的化学修饰
，具体而言，本专利技术涉及一种基于缺电子苯甲醛类化合物的无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质化学修饰方法。
技术介绍
多肽及蛋白质化学修饰从无到有发展至今一直都是化学生物学领域中极为重要的一个部分(Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，6974.)。腙连接反应因其良好的生物正交性在多肽及蛋白质化学修饰领域有广泛应用。目前应用腙连接方法进行多肽及蛋白质修饰的方法主要有以下几种：(1)基于苯胺或苯胺类催化剂催化的腙连接反应。多肽及蛋白质修饰反应需要在中性条件下进行，然而腙连接反应在不外加催化剂时在中性pH下的反应效率极低，而外加入苯胺或者苯胺类催化剂可以极大的提高腙连接反应在中性pH下的反应效率(Angew.Chem.，Int.Ed.2006，45，7581.)。然而，催化剂的用量较多，会增加反应体系的复杂性，并且苯胺类物质还具有较高的生物毒性。因此，在实践中，这种外加入催化剂的腙连接方法的应用受到很大的限制。(2)基于快速反应试剂的无催化剂添加的腙连接反应。通过优化腙连接反应的底物分子结构获得快速反应试剂，这种结构优化的试剂可在不添加催化剂的中性pH下进行高效的腙连接反应。常见的应用快速反应试剂的腙连接反应有下述三种：第一种是基于喹啉-8-甲醛或者吡啶-2-甲醛的腙连接反应，这两种化合物可以在中性条件下与苯肼高效反应(J.Am.Chem.Soc.2013，135，17663.)；第二种是基于磷酸吡哆醛的腙连接反应，这种化合物可以进一步携带荧光分子，并对蛋白质实现腙连接反应修饰(BioconjugateChem.2012，23，2329.)；第三种是基于邻氯苯甲醛的腙连接反应，这种化合物也可进一步携带荧光分子，并对多肽及蛋白质实现腙连接反应修饰(Chem.Commun.2015，51，13189.)。迄今为止，传统的腙连接反应因需要添加毒性催化剂，而被限制了应用范围。新型的无催化剂添加的腙连接反应的方法虽然有不少，但是能便捷普适的用于肽和/或蛋白质修饰的方法却不多，有些方法仅仅实现模型分子层面的反应，有些则只能对多肽及蛋白质进行简单的荧光分子的修饰。因此，本领域仍然需要研发快速、高效的无催化剂添加的腙连接多肽和/或蛋白质修饰方法。
技术实现思路
为了克服现有的腙连接多肽和/或蛋白质修饰方法的缺点，本专利技术的目的是研发一种快速、高效的无催化剂添加的腙连接多肽和/或蛋白质修饰方法。具体而言，本专利技术人通过在2-氯苯甲醛的对位引入了拉电子取代基(烯烃双键)使醛基具备缺电子性，进而提高醛基反应活性。该类缺电子苯甲醛类化合物可作为一种快速反应试剂用于无催化剂添加的腙连接反应，通过借助这种快速反应试剂或其衍生物对多肽或蛋白质进行复杂分子的修饰。利用这种方法，本专利技术不仅能够实现多肽或蛋白质的简单分子修饰(如荧光分子)，还可以实现对于蛋白质进行复杂药物分子的修饰反应。因此，本专利技术提供了一种高效便捷且普适性好的无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法。在此基础上，本专利技术人完成了本专利技术。在第一方面，本专利技术提供一种无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法，所述方法包括下述步骤：在水相缓冲液的条件下，以式III所示的缺电子的苯甲醛类化合物作为亲电试剂，以式II所示的多肽或蛋白质的酰肼作为亲核试剂进行腙连接反应，得到具有通式I所示的结构的腙连接产物。反应式示意如下：所述水相缓冲液为盐类缓冲液，优选PBS缓冲液、PME水相缓冲液等常见生物缓冲液，更优选使用PME水相缓冲液(100mMPIPES，1mMMgSO4，2mMEGTA，pH6.0-8.0)。本领域技术人员能够选择合适的水相缓冲液。所述亲核试剂是多肽或蛋白质的酰肼，其可以选自具有通式II结构的化合物。本领域技术人员应该理解，多肽或蛋白质的酰肼可以通过本领域常规的固相多肽或蛋白质合成技术或基因重组表达技术制备得到。其中通过基因重组表达技术制备多肽或蛋白质的酰肼的方法是本领域常规的方法，例如，以泛素蛋白酰肼(Ub(1-75)酰肼)为例，其重组表达方法如下：使用构建的pTXB1-Ub(1-75)重组表达载体(其中表达载体pTXB1购自NewEnglandBiolab，Beverly，MA；全合成引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其中5’引物为5’-GGTGGTCATATGCCGTCCGAGAAGACCT-3’，3’引物为5’-GGTGGTTGCTCTTCCGCACGTCTCCTGGGAGGC-3’；酶切位点为NdeI和BspQI；编码的蛋白序列为MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRG；利用常规分子克隆技术构建)转化进大肠杆菌ER2566(NEB)细胞。使用添加了0.2mMIPTG的1升LB培养基培养细胞至OD600达到0.6。细胞液使用超声破碎并且离心沉淀不溶物，收集上清。使用几丁质树脂回收蛋白，并用切割缓冲液(20mMTris-HCl，300mMNaCl，4％NH2NH2·H2O，pH7.5)处理吸附有蛋白的树脂约4小时。收集切割缓冲液并使用超滤管浓缩至小体积，再使用分析型色谱以及质谱进行分析鉴定，之后再使用半制备色谱进行分离，最终得到泛素蛋白质酰肼。对于其他多肽或蛋白质的酰肼，本领域技术人员也能够根据需要选择合适的固相多肽或蛋白质合成技术或基因重组表达技术进行制备。所述亲电试剂是缺电子的苯甲醛类化合物，其可以选自具有通式III结构的化合物，其中，R可以为结构多变的取代基，如小分子化合物取代基，例如，但不限于，甲基、荧光分子取代基、药物分子取代基等。从式III的结构式来看，苯环上的烯烃双键的拉电子性使得处于苯环对位的醛基处于缺电子的状态，从而增强了醛基的反应活性。优选地，所述亲电试剂如式1所示(即，此时R为CH3)或式2所示(即，此时R为)：式1的化合物的名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸甲酯[methyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]；式2的化合物的名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸2-((7-硝基苯并[c][1，2，5]噁二唑-4-基)氨基)乙酯[2-((7-nitrobenzo[c][1，2，5]oxadiazol-4-yl)amino)ethyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]。在一个实施方案中，本专利技术人合成了式3所示的亲电试剂，其对应通式III中R为达沙替尼药物分子取代基。式3的化合物的名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸2-(4-(6-((5-((2-氯-6-甲基苯基)氨甲酰基)噻唑-2-基)氨基)-2-甲基嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙酯[2-(4-(6-((5-((2-chloro-6-methylphenyl)carbamoyl)thiazol-2-yl)amino)-2-methylpyrimidin-4-yl)piperazin-1-yl)ethyl(E)-3-(3-chloro-4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法，所述方法包括下述步骤：

【技术特征摘要】
1.一种无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法，所述方法包括下述步骤：在水相缓冲液的条件下，以式III所示的缺电子的苯甲醛类化合物作为亲电试剂，以式II所示的多肽或蛋白质的酰肼作为亲核试剂进行腙连接反应，得到具有通式I所示的结构的腙连接产物，其中，在式III中，R为结构多变的取代基，例如，甲基、荧光分子取代基、药物分子取代基等。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述水相缓冲液为盐类缓冲液，如PBS缓冲液、PME缓冲液等。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽或蛋白质的酰肼通过固相多肽或蛋白质合成技术或基因重组表达技术制备得到。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述缺电子的苯甲醛类化合物为式1、式2或式3所示：5.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲核试剂的浓度为10-1000微摩尔/升，亲电试剂浓度为10-20000微摩尔/升。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：许杨，石景，王玉，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34