一种烟草基因编辑素材中无机阳离子的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种适合烟草基因编辑素材5种无机阳离子的测定方法，使用以下装置：样品萃取瓶，包括：外套管(1)；内套管(2)；导液管(4)；筛板(3)，位于所述内套管(2)的下端开口内，为一个或多个；该方法包括以下步骤：①烟叶萃取；②过滤和转移；③分析作出色谱图；④与标准色谱图的峰面积，即可得到烟草基因编辑素材无机阳离子的含量。本发明专利技术的测定方法首次使用在离子色谱分析柱前加一个在线固相萃取净化柱，具有处理简单、方便、效果好的优点，测定方法具有定量准确、重复性好、检出限低等优点，有效实现烟草基因编辑素材中无机阳离子的高通量分析测定。

【技术实现步骤摘要】
一种烟草基因编辑素材中无机阳离子的测定方法
本专利技术涉及分析化学
，具体是涉及一种烟草基因编辑素材中无机阳离子的测定方法。
技术介绍
钾、钠、钙、镁和铵是烟草生长发育所必须的营养元素，而且成品烟叶中这些元素的含量还和烟叶品质具有密切的相关性。因此烟草中钾、钠、钙、镁和铵的准确测定对烟草的生长、发育和品质评价均有重要意义。目前钾、钠、钙、镁的测定一般采用连续流动分析法、原子吸收光谱法、近红外光谱法、原子发射光谱法；氨的测定一般采用连续流动分析法、离子色谱和离子选择电极法。也可用离子色谱法同时测定钾、钠、钙、镁和铵。离子色谱法简便、快速、干扰少，近年来在测定烟草无机阳离子得到了广泛应用。但是烟草样品基质背景复杂，目前报道方法中，在离子色谱分析前对样品进行净化处理能获得更好的效果，在样品净化过程中需多次转移样品，操作步骤多。目前烟草行业启动了烟草基因编辑工厂化育种工作，通过钾、钠、钙、镁和氨的测定了解编辑素材的生长发育和品质是素材筛选的重要内容。但是，在基因编辑工厂化育种过程中通过基因编辑将产生数万个素材。要对这些海量的素材进行化学分析评价评价，常规方法很难满足需求。在进行烟草基因编辑素材品质评价过程中，需要寻找一种更简便、快速的分析方法，可批量、高通量操作，实现快速、高效、准确的测定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种烟草基因编辑素材中阳离子的测定方法，为烟草基因育种筛选评价提供方法支持。本专利技术的方法集在线固相萃取净化功能的离子色谱分析，可有效实现烟草基因编辑素材中阳离子的高通量分析测定。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的。一种烟草基因编辑素材中阳离子的测定方法，其特征在于，使用以下装置：样品萃取瓶，包括：外套管1，其底部密封且为平底，其口部有一密封圈11；内套管2，其外径与所述外套管1的内径相适配，其的长度大于所述外套管1的长度；导液管4，位于所述内套管2内，其下端有一扩张口与所述内套管2的下端内壁密封固定连接，其与所述内套管2上端口固定连接形成受压面21，其上部伸出所述内套管2外部，并回弯向下；筛板3，位于所述内套管2的下端开口内，为一个或多个；该方法包括以下步骤：①将烟叶在-80℃下冷冻，然后在40℃烘干，粉碎并过40目筛；②称取步骤1得到的粉末0.2g于所述外套管1中，加入50mL萃取剂，将所述内套管2的一部分插入到所述外套管1中并被所述密封圈11密封，然后在一定温度下超声萃取20min；③在所述受压面21施加向下的力，则所述外套管1中的萃取溶液通过所述筛板3被过滤后进入所述导液管4中，并从导液管4流出进入到样品收集瓶中，冷却至室温得到待分析的样品滤液；收集样品滤液1-1.5mL，进行在线净化离子色谱分析；④采用峰面积法进行定量，通过样品中无机阳离子的峰面积与标准工作曲线对比，即可确定所述烟草基因编辑素材中无机阳离子的含量。本专利技术的阳离子为钾离子(K+)，钠离子(Na+)，钙离子(Ca2+)，镁离子(Mg2+)或铵根离子(NH4+)中的一种或几种。优选地，步骤②所述的萃取试剂为5wt％的盐酸水溶液。优选地，步骤②所述的萃取温度为50℃。优选地，步骤③所述的筛板的孔径为0.45μm。优选地，步骤③所述的在线净化离子色谱法为，在离子色谱分析柱前加一个在线固相萃取净化。萃取柱填料为MCI-GEL反向树脂，在线固相萃取柱的规格为4×10mm，填料粒径为5.0μm，萃取容量为30mg。优选地，步骤③所述的在线净化离子色谱条件为：在线固相萃取净化柱接在离子色谱分析柱前端，离子色谱条件：IonPacCS12A阳离子交换色谱柱(3×150mm，5μm)；流动相为30mmol/L甲基磺酸水溶液；柱温：40℃；柱流速：0.8mL/min；进样量：10μL；等度洗脱；电导检测器检测。在本专利技术的技术方案中，所述的在线固相萃取净化柱可以连续进样500次，超过500次后，将净化柱反接在液相色谱泵端，利用100％甲醇，1.0mL/min流速进行反洗1h后，即可重新进行使用。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：①本专利技术提供了烟草基因编辑素材中阳离子的测定方法，根据本方法对比不同素材或者基因编辑素材与正常烟叶样品中钾离子(K+)，钠离子(Na+)，钙离子(Ca2+)，镁离子(Mg2+)，铵根离子(NH4+)的含量，进行不同烟叶品质的判定评价。②本专利技术的方法还提供了一种集在线固相萃取净化功能的离子色谱分析。烟草样品无机阳离子分析过程中，样品萃取液中会含有少量的蜡质，色素、多酚、脂肪类物质等物干扰成分，这些成分不能被离子色谱的流动相洗脱，容易在色谱柱上残留污染色谱柱，进而影响分析结果。采用固相萃取进行样品前处理能得较好的分析效果；但固相萃取的引入增加了样品前处理操作步骤。采用在离子色谱柱前接MCI-GEL反向树脂填料的在线固相萃取柱；当样品随流动相通过固相萃取柱时，小极性成分富集在固相萃取柱上，不能被离子色谱的流动相洗脱。而待测的无机阳离子在反相固相萃取柱上没有保留，可通过固相萃取柱后再进入离子色谱柱分离，这样可在线达到固相萃取净化的效果。样品过程就不需要单独进行固相萃取操作，可通过在线固相萃取除去样品萃取液中的干扰成分。大大简化了样品前处理操作，通过在线固相萃取有效简化了样品前处理操作，避免了离线固相萃取操作样品转移所带来的实验误差，具有前处理简单、方便、净化效果好、样品处理通量高、定量准确、等优点，适用于大批量样品的准确测试。可为海量烟草基因编辑素材样品的检测评价提供准确可靠的方法，为烟叶品质评价提供有效的技术支持。③本专利技术的方法中选择在离子色谱柱前接MCI-GEL反向树脂填料的在线固相萃取柱；MCI-GEL反向树脂基体是聚苯乙烯和二乙烯基共聚物，和C18具有相似的保留行为，但使用的pH范围比C18宽，在pH0-14范围内均可稳定使用，因此在离子色谱的碱性流动相条件下可长期稳定使用；成功解决了常规固相萃取材料(C18等)使用pH范围窄，在碱性条件下易分解，无法适用于离子色谱的碱性流动相的缺陷。而且MCI-GEL反相树脂可不经活化直接固相萃取，和在线固相萃取方法兼容性好。④本专利技术的方法中对离子色谱条件进行了优化，优化后，钾离子(K+)，钠离子(Na+)，钙离子(Ca2+)，镁离子(Mg2+)，铵根离子(NH4+)5种无机阳离子的离子色谱分析时间只需5min，和现有烟草行业标准YC/T248-2008相比，分析时间缩短3倍以上。进一步大幅度提高了样品分析效率⑤本专利技术使用的装置，样品的前处理过程中不需要转移样品就可以直接萃取、过滤并收集得到待分析样品，有效避免了操作所带来的实验误差，具有处理简单、方便、效果好的优点。附图说明图1为本专利技术的外套管示意图；图2为本专利技术的内套管示意图；图3为本专利技术的萃取混合时内套管插入外套管口部示意图；图4为本专利技术的萃取液过滤、转移时内套管插入外套管内部示意图；图5为本专利技术的一个样品萃取瓶放置在样品萃取架上和样品收集瓶放置在样品收集架上时样品转移步骤的示意图；图6为5种阳离子标准溶液；图7为烟草基因编辑素材中5种阳离子色谱图。附图说明：1-外套管；2-内套管；21-受压面；3-筛板；4-导液管；5-样品萃取架；51-样品萃取瓶放置孔；6-样品收集架；61-样品瓶放本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草基因编辑素材中阳离子的测定方法，其特征在于，使用以下装置：样品萃取瓶，包括：外套管(1)，其底部密封且为平底，其口部有一密封圈(11)；内套管(2)，其外径与所述外套管(1)的内径相适配，其的长度大于所述外套管(1)的长度；导液管(4)，位于所述内套管(2)内，其下端有一扩张口与所述内套管(2)的下端内壁密封固定连接，其与所述内套管(2)上端口固定连接形成受压面(21)，其上部伸出所述内套管(2)外部，并回弯向下；筛板(3)，位于所述内套管(2)的下端开口内，为一个或多个；该方法包括以下步骤：①将烟叶在‑80℃下冷冻，然后在40℃烘干，粉碎并过40目筛；②称取步骤(1)得到的粉末0.2g于所述外套管(1)中，加入50mL萃取剂，将所述内套管(2)的一部分插入到所述外套管(1)中并被所述密封圈(11)密封，然后在一定温度下超声萃取20min；③在所述受压面(21)施加向下的力，则所述外套管(1)中的萃取溶液通过所述筛板(3)被过滤后进入所述导液管(4)中，并从导液管(4)流出进入到样品收集瓶中，冷却至室温得到待分析的样品滤液；收集样品滤液1‑1.5mL，进行在线净化离子色谱分析；④采用峰面积法进行定量，通过样品中无机阳离子的峰面积与标准工作曲线对比，即可确定所述烟草基因编辑素材中无机阳离子的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种烟草基因编辑素材中阳离子的测定方法，其特征在于，使用以下装置：样品萃取瓶，包括：外套管(1)，其底部密封且为平底，其口部有一密封圈(11)；内套管(2)，其外径与所述外套管(1)的内径相适配，其的长度大于所述外套管(1)的长度；导液管(4)，位于所述内套管(2)内，其下端有一扩张口与所述内套管(2)的下端内壁密封固定连接，其与所述内套管(2)上端口固定连接形成受压面(21)，其上部伸出所述内套管(2)外部，并回弯向下；筛板(3)，位于所述内套管(2)的下端开口内，为一个或多个；该方法包括以下步骤：①将烟叶在-80℃下冷冻，然后在40℃烘干，粉碎并过40目筛；②称取步骤(1)得到的粉末0.2g于所述外套管(1)中，加入50mL萃取剂，将所述内套管(2)的一部分插入到所述外套管(1)中并被所述密封圈(11)密封，然后在一定温度下超声萃取20min；③在所述受压面(21)施加向下的力，则所述外套管(1)中的萃取溶液通过所述筛板(3)被过滤后进入所述导液管(4)中，并从导液管(4)流出进入到样品收集瓶中，冷却至室温得到待分析的样品滤液；收集样品滤液1-1.5mL，进行在线净化离子色谱分析；④采用峰面积法进行定量，通过样品中无机阳离子的峰面...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈章玉，李晶，李雪梅，米其利，陈建华，耿永勤，张承明，缪恩铭，杨光宇，田丽梅，向明，蒋次清，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53