蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，涉及蜂王浆检测技术领域，其技术方案要点是包括以下步骤：（1）标准溶液的配制；（2）蜂王浆前处理：称取2g蜂王浆，放置在离心管中，加入0.1ml吡虫啉D4内标工作液和0.1ml多菌灵D3内标工作液，旋涡混匀，再加入质量浓度为30%的乙醇涡旋使溶液充分溶解，再加入PH值为7.5‑8的甘氨酸‑盐酸缓冲液15ml，旋涡振荡1min，超声波处理15min；（3）蜂王浆后处理；（4）色谱检测；（5）质谱检测。本发明专利技术解决了不能同时检测多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的问题，利用PH值为7.5‑8的甘氨酸‑盐酸缓冲液，能够同时检测三种物质，且方法简单、快速、灵敏。

【技术实现步骤摘要】
蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法
本专利技术涉及蜂王浆检测
，更具体的说，它涉及一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法。
技术介绍
蜂王浆是工蜂食用花粉后分泌的一种乳状物，蜂王浆中富含多中人体所需的营养成分，如氨基酸、维生素、微量元素和矿物质等，具有降低胆固醇、防衰老、保护肝脏、降血脂、增强免疫力、促进组织再生等功能。花源植物由于易感染病虫害，常会被喷洒各种农药，现农药中使用较多的是多菌灵杀菌剂，多菌灵是高效低毒内吸性杀菌剂，有内吸治疗和保护作用，它的作用机理是干扰花源植物中病原菌在有丝分裂过程中纺锤体的形成，进而影响病原菌的细胞分裂，起到杀死病菌的作用；与多菌灵作用机理相同的一类杀菌剂有甲基托布津和乙基托布津；工蜂在食用喷洒过农药的花粉后，在分泌蜂王浆时，农药中某些成分会残留在蜂王浆内，若蜂王浆中农药成分过量，会对人体造成不利影响，因此需要对蜂王浆内多菌灵、甲基托布津和乙基托布津进行检测。现有标准GBT20769《水果和蔬菜中450中农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》中用液相色谱-串联质谱法测定蜂王浆中多菌灵，但并没有记载甲基托布津和乙基托布津的检测方法；现有标准GB/T30771-2008《蜂蜜中486种农药及相关化学拼残留量的测定液相色谱-串联质谱法》中有蜂王浆中多菌灵和甲基托布津的检测方法，但没有乙基托布津的检测方法，且液相色谱-串联质谱法需要使用有机溶剂在分液漏斗中液液萃取2次，浓缩2次，再固液萃取2次，操作较为繁琐。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，其通过用弱碱性甘氨酸-盐酸缓冲液对蜂王浆进行前处理，能够同时检测多菌灵、甲基托布津和乙基托布津且方法简单、快速、灵敏。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，包括以下步骤：(1)标准溶液的配制：1.1标准储备液：分别称取多菌灵、甲基托布津和乙基托布津，均用乙腈作溶剂定容在100mL的容量瓶中，配制成质量溶度为100mg/L的标准储备液，然后放在4℃下避光保存；1.2标准工作液：分别量取所述多菌灵标准储备液、甲基托布津标准储备液和乙基托布津标准储备液，并将三种标准储备液混合均匀，再用乙腈进行稀释，配制成1mg/L和0.1mg/L的混合标准溶液，然后放在4℃下避光保存；1.3内标储备液：分别称取一定量的内标多菌灵D3和内标吡虫啉D4，用适量甲醇作溶剂，并定容在100mL的容量瓶中，配制成质量浓度为100mg/L的内标储备液，然后放在4℃下避光保存；1.4内标工作液：分别量取一定量的多菌灵D3内标储备液和吡虫啉D4内标储备液，用甲醇定容，将多菌灵D3内标储备液的质量浓度配制成100ng/L，制成多菌灵D3内标工作液，将吡虫啉D4内标储备液的质量浓度配制成100ng/L，制成吡虫啉D4内标工作液；(2)蜂王浆前处理：称取2g蜂王浆，放置在离心管中，加入0.1mL吡虫啉D4内标工作液和0.1mL多菌灵D3内标工作液，旋涡混匀，再加入质量浓度为30％的乙醇涡旋使溶液充分溶解，再加入PH值为7.5-8的甘氨酸-盐酸缓冲液15mL，旋涡振荡1min，超声波处理15min；(3)蜂王浆后处理：用活化后的HLB固相萃取柱，取上清液上样，用5mL水润洗小柱，再用5mL乙腈洗脱，洗脱液在40-45℃下水浴下氮气吹干，用5mL体积比为1：1的乙腈和水溶液溶解并定容至1mL，过0.22um油系微孔滤膜，得滤液；(4)色谱检测：用SepaxGP-C18色谱柱(150mm×4.6mm，5um)进行检测；(5)质谱检测：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描模式；检测模式：多反应检测模式；喷雾电压：3000V；毛细管温度：350℃；雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；雾化气压为450kPa；辅助加热气压：350kPa；气帘气压70kPa，碰撞气压：40kPa。通过采用上述技术方案，先用乙醇溶解蜂王浆，使蜂王浆完全溶解，无颗粒物，蜂王浆本身偏酸性，溶于水后也呈酸性，本专利技术所要检测的三个成分偏碱性，在蜂王浆的乙醇溶液中呈分子状态，难以被提取到有机溶剂中，用乙醇先溶解蜂王浆，能够使蜂王浆溶解完全，再用PH在7.5-8之间呈弱碱性的甘氨酸-盐酸缓冲液溶解和稀释蜂王浆，保证溶液在PH为7.5-8之间，待检测物质呈分子状态，有利于后续有机溶剂提取或固相萃取净化，利用超声波处理，溶解残渣，提高有机溶剂的提取；因为蜂王浆中含有大量的糖类，会影响目标物的提取，分散固相萃取并不能去除蜂王浆中的各种杂质，从而导致基质抑制，而使回收率较低，且多菌灵、甲基托布津和乙基托布津的分子结构中均含氨基，且多菌灵具有一定的极性，甲基托布津和乙基托布津的极性较小，用HLB固相萃取柱进行净化，同时使用同位素内标法定量，净化效果好，回收率更高、更稳定；在质谱检测中，使用正离子模式进行电离，因为多菌灵、甲基托布津和乙基托布津和同位素内标多菌灵D3和吡虫啉D4的分子结构中，均含有氨基，容易分解成正离子，所以需要采用正离子模式进行电离。本专利技术进一步设置为：所述PH值为7.5-8的甘氨酸-盐酸缓冲液溶液的配制方法为：取50mL浓度为0.2mol/L的甘氨酸和5mL浓度为0.2mol/L的盐酸，加水稀释至200mL，再用5mol/L的氨水调节至PH值为7.5-8，加水至1000mL。通过采用上述技术方案，50mL浓度为用0.2mol/L的甘氨酸和5mL浓度为0.2mol/L盐酸，加水稀释至200mL，用氨水调节后PH能够为7.7-8之间，使待检测物呈分子状态，有利于后续有机溶剂的提取和固相萃取净化。本专利技术进一步设置为：所述步骤(3)中小柱润洗后用2mL空气吹干。通过采用上述技术方案，用压缩空气吹干时，风压较大，气流量比较大，可以把水珠吹掉，提高效率。本专利技术进一步设置为：所述步骤(2)中超声波处理后的溶液要在转速为5000r/min，离心半径为6cm的条件下离心5min。通过采用上述技术方案，利用超声波处理后的溶液进行离心处理，可进一步去除蜂王浆中的杂质和残渣。本专利技术进一步设置为：所述步骤(3)中活化HLB萃取柱的方法为：先用5mL的甲醇活化，再用5mL的水活化。通过采用上述技术方案，用甲醇先活化，能够打开键合在萃取柱上的碳基团链，使碳基团链充分发生作用，与碳链互溶，再用水活化，能够和待检测液相溶。本专利技术进一步设置为：所述步骤(2)中加入PH值为7.5-8的甘氨酸-盐酸缓冲液前，加入15g无水硫酸钠，用力振摇6min。通过采用上述技术方案，因为样品中含有水，用乙醇溶解后，上层样液中仍然含有水，溶于水的极性化合物会影响样品的净化效果，添加无水硫酸钠，可完全脱除样液中的水，提高样品的净化效果。本专利技术进一步设置为：所述步骤(3)中上样速率为5mL/min。通过采用上述技术方案，控制上样速率为5mL/min，能够使样品溶液滴加速度较慢，使样品充分得到检测。本专利技术进一步设置为：所述步骤(4)中检测条件为：柱温：30；进样量：20uL；流速：0.25mL/min；流动相：A相为0.5mmol/L乙酸铵水溶液，含有1％的甲酸，B相为甲醇；采用梯度洗脱方式：0-6.5min，95％A-50％A；6.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）标准溶液的配制：1.1标准储备液：分别称取多菌灵、甲基托布津和乙基托布津，均用乙腈作溶剂定容在100mL的容量瓶中，配制成质量溶度为100mg/L的标准储备液，然后放在4℃下避光保存；1.2标准工作液：分别量取所述多菌灵标准储备液、甲基托布津标准储备液和乙基托布津标准储备液，并将三种标准储备液混合均匀，再用乙腈进行稀释，配制成1mg/L和0.1mg/L的混合标准溶液，然后放在4℃下避光保存；1.3内标储备液：分别称取一定量的内标多菌灵D3和内标吡虫啉D4，用适量甲醇作溶剂，并定容在100mL的容量瓶中，配制成质量浓度为100mg/L的内标储备液，然后放在4℃下避光保存；1.4内标工作液：分别量取一定量的多菌灵D3内标储备液和吡虫啉D4内标储备液，用甲醇定容，将多菌灵D3内标储备液的质量浓度配制成100ng/L，制成多菌灵D3内标工作液，将吡虫啉D4内标储备液的质量浓度配制成100ng/L，制成吡虫啉D4内标工作液；（2）蜂王浆前处理：称取2g蜂王浆，放置在离心管中，加入0.1mL吡虫啉D4内标工作液和0.1mL多菌灵D3内标工作液，旋涡混匀，再加入质量浓度为30%的乙醇涡旋使溶液充分溶解，再加入PH值为7.5‑8的甘氨酸‑盐酸缓冲液15mL，旋涡振荡1min，超声波处理15min；（3）蜂王浆后处理：用活化后的HLB固相萃取柱，取上清液上样，用5mL水润洗小柱，再用5ml乙腈洗脱，洗脱液在40‑45℃下水浴下氮气吹干，用5mL体积比为1：1的乙腈和水溶液溶解并定容至1mL，过0.22um油系微孔滤膜，得滤液；（4）色谱检测：用SepaxGP‑C18色谱柱（150mm×4.6mm，5um）进行检测；（5）质谱检测：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描模式；检测模式：多反应检测模式；喷雾电压：3000V；毛细管温度：350℃；雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；雾化气压为450kPa；辅助加热气压：350kPa；气帘气压70kPa，碰撞气压：40kPa。...

【技术特征摘要】
1.一种蜂王浆中多菌灵类成分的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）标准溶液的配制：1.1标准储备液：分别称取多菌灵、甲基托布津和乙基托布津，均用乙腈作溶剂定容在100mL的容量瓶中，配制成质量溶度为100mg/L的标准储备液，然后放在4℃下避光保存；1.2标准工作液：分别量取所述多菌灵标准储备液、甲基托布津标准储备液和乙基托布津标准储备液，并将三种标准储备液混合均匀，再用乙腈进行稀释，配制成1mg/L和0.1mg/L的混合标准溶液，然后放在4℃下避光保存；1.3内标储备液：分别称取一定量的内标多菌灵D3和内标吡虫啉D4，用适量甲醇作溶剂，并定容在100mL的容量瓶中，配制成质量浓度为100mg/L的内标储备液，然后放在4℃下避光保存；1.4内标工作液：分别量取一定量的多菌灵D3内标储备液和吡虫啉D4内标储备液，用甲醇定容，将多菌灵D3内标储备液的质量浓度配制成100ng/L，制成多菌灵D3内标工作液，将吡虫啉D4内标储备液的质量浓度配制成100ng/L，制成吡虫啉D4内标工作液；（2）蜂王浆前处理：称取2g蜂王浆，放置在离心管中，加入0.1mL吡虫啉D4内标工作液和0.1mL多菌灵D3内标工作液，旋涡混匀，再加入质量浓度为30%的乙醇涡旋使溶液充分溶解，再加入PH值为7.5-8的甘氨酸-盐酸缓冲液15mL，旋涡振荡1min，超声波处理15min；（3）蜂王浆后处理：用活化后的HLB固相萃取柱，取上清液上样，用5mL水润洗小柱，再用5ml乙腈洗脱，洗脱液在40-45℃下水浴下氮气吹干，用5mL体积比为1：1的乙腈和水溶液溶解并定容至1mL，过0.22um油系微孔滤膜，得滤液；（4）色谱检测：用SepaxGP-C18色谱柱（150mm×4.6mm，5um）进行检测；（5）质谱检测：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描模式；检测模式：多反应检测模式；喷雾电压：30...

【专利技术属性】
技术研发人员：张暘，
申请(专利权)人：杭州康力食品有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33