鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的方法及其专用引物技术

本发明专利技术公开了鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的方法及其专用引物。本发明专利技术提供了一种用于鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的引物对，由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成。本发明专利技术所提供的辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的方法及其专用引物能有效地检测出对多菌灵表现为敏感或高抗的甜菜褐斑病菌，检测方法具有很高的特异性，且整个检测过程快速，检测成本较低，可操作性较强。因此，本发明专利技术所设计的引物和检测方法可用来快速、准确的检测甜菜褐斑病菌对多菌灵的抗性水平。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的方法及其专用引物。
技术介绍
甜菜是世界第二大糖料作物，是我国北方地区最主要的经济作物之一，在国民经济中占有重要的地位。甜菜生尾孢菌(Cercospora beticola Sacc.)引起的甜菜褐斑病是生产上最重要的叶部真菌病害，主要危害甜菜的叶、茎及种株的花序，但以叶片为主，破坏甜菜的光合作用器官，降低植株的光合作用，影响甜菜块根的增大和糖分的积累，同时该病也可为害甜菜的块根，加重储藏期间块根的腐烂。病害爆发流行时，可造成甜菜减产40%或以上，含糖量下降1-3度。由于抗病的甜菜品种产量、含糖量和经济效益较低，生产上普遍采用高产和含糖量较高的甜菜品种，然而这些品种抗褐斑病的能力普遍较低，因此化学防治是目前防治甜菜褐斑病、提高经济效益最有效的方法。多菌灵是当前生产中防治甜菜褐斑病的主要药剂之一，由于一些地区长期大量使用该类药剂，甜菜褐斑病菌已对该药剂产生了明显的抗性。 因此检测甜菜褐斑病菌对多菌灵的抗性情况，从而根据检测结果指导田间合理用药，能有效地延缓和治理病原菌对杀菌剂的抗药性。已有研究发现，β-微管蛋白基因编码的第198位或200位氨基酸的密码子发生点突变是导致大多数病原菌对杀菌剂产生抗药性的主要原因(Koenraadt H， Somerville SCand Jones AL, Characterization of mutations in the beta-tubulin gene of benomyl-resistantfield strains of Venturia inaequalis and other plant pathogenic fungi. Phytopathology 1992,82:1348-1354)。黄大昉等首先报道了我国甜菜褐斑病对多菌灵的抗药性，而Davidson等首次报道了甜菜褐斑病菌菌株中β “微管蛋白基因编码的第198位氨基酸的密码子由GAG突变为GCG，从而导致其所编码的氨基酸由Glu(谷氨酸)突变为Ala(丙氨酸)，该突变降低了病原菌与苯并咪唑类杀菌剂间的亲和力，致使菌株对苯并咪唑类杀菌剂表现出高水平的抗性(Davidson R Μ, Hanson L E andFranc G D et al. Analysis of b—tubulin Gene Fragments from Benzimidazole-sensitive and—tolerant Cercospora beticola. J. Phytopathology, 2006，154 :321-328)。专利技术人对2009年从田间收集到的64个甜菜褐斑病菌分离物(11个高抗菌株，53个敏感菌株)进行了微管蛋白基因分析，高抗菌株的抗性突变与Davidson 等报道的结果一致。传统的用于检测病原菌对杀菌剂抗药性的生物测定方法费时、费力，不能及时、准确地为田间病害防治提供科学可靠地指导，因此，建立一种新的快速、准确分子检测方法， 准确地检测甜菜褐斑病菌对多菌灵的抗性具有重要的实际意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的引物对。本专利技术所提供的用于鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的引物对， 由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成。本专利技术的另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的引物组合物。本专利技术所提供的用于鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的引物组合物，由引物对A和引物对B组成；所述引物对A为所述的引物对；所述引物对B由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列3所示的引物组成。本专利技术所提供的弓丨物组合物中的引物对A的反向引物3 ‘末端碱基为G，使得其与抗性菌株β -微管蛋白基因的碱基C配对，而不能与敏感菌株β -微管蛋白基因的碱基A配对，引物对A的反向引物3'末端倒数第二个碱基为G，使得该反向引物与敏感菌株β-微管蛋白基因的两个碱基产生错位，在一定的PCR条件下只能扩增到抗性菌株微管蛋白基因的DNA片段；引物对B的反向引物3'末端碱基为Τ，使得其与敏感菌株β-微管蛋白基因的碱基A配对，而不能与抗性菌株β -微管蛋白基因的碱基C配对，引物对B的反向引物的3'末端倒数第二个碱基为Α，使得该反向引物与抗性菌株β-微管蛋白基因的两个碱基产生错位，在一定的PCR条件下只能扩增敏感菌株β-微管蛋白基因的DNA片段；引物对 A和引物对B的正向引物相同，该正向引物位于微管蛋白基因的第四个内含子内，是甜菜褐斑病菌微管蛋白基因的种特异性序列。本专利技术的又一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的方法。本专利技术所提供的鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的方法，包括以下步骤以待鉴定真菌菌株的基因组DNA为模板，用所述的引物组合物中的引物对A进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物I ；同时，用所述的弓I物组合物中的引物对B进行PCR扩增，得到PCR扩增产物II ；检测所述PCR扩增产物I和PCR扩增产物II，若所述PCR扩增产物I为493bp的片段，且所述PCR扩增产物II不为493bp的片段，则确定所述待鉴定真菌菌株为或候选为对多菌灵产生抗性的甜菜褐斑病致病菌；若所述PCR扩增产物I不为493bp的片段，且所述PCR扩增产物II为493bp的片段，则确定所述待鉴定真菌菌株为或候选为对多菌灵敏感的甜菜褐斑病致病菌。所述检测所述PCR扩增产物I和PCR扩增产物II的方法为如下A)或B)所示A)将所述PCR扩增产物I和PCR扩增产物11进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据检测结果鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性；B)将所述PCR扩增产物I和PCR扩增产物11进行测序，根据测序结果鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性。所述A)中所述根据检测结果鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的方法为若所述PCR扩增产物I在凝胶上显示为400bp-500bp的条带，且所述PCR扩增产物II没有在凝胶上显示为400bp-500bp的条带，则确定所述待鉴定真菌菌株为或候选为对多菌灵产生抗性的甜菜褐斑病致病菌；若所述PCR扩增产物I没有在凝胶上显示为 400bp-500bp的条带，且所述PCR扩增产物II在凝胶上显示为400bp_500bp的条带，则确定所述待鉴定真菌菌株为或候选为对多菌灵敏感的甜菜褐斑病致病菌。所述用所述的引物组合物中的引物对A进行PCR扩增的反应条件为95°C预变性 1分钟；然后按照下列参数进行循环反应95°C变性45秒，65. 5°C复性30秒，72°C延伸45 秒；循环35次；循环反应结束后在72°C保持10分钟；所述用所述的引物组合物中的引物对B进行PCR扩增的反应条件为95°C预变性 1分钟；然后按照下列参数进行循环反应95°C变性45秒，64°C复性30秒，72°C延伸45秒； 循环35次；循环反应结束后在72°C保持10分钟。本专利技术的又一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的方法。本专利技术所提供的鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的方法，包括以下步骤以待鉴定菌株的基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于鉴定或辅助鉴定甜菜褐斑病致病菌对多菌灵抗性的引物对，由序列表中序列１所示的引物和序列表中序列２所示的引物组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴学宏，林杰，刘梅，韩成贵，李大伟，于嘉林，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11