一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。本发明专利技术基于GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组所包含的三个开放阅读框，采用了“4+1+1”的分段扩增策略，在保守区域设计了六对扩增引物和两条基因组两端的测序引物，以目标病毒RNA为模板进行RT‑PCR扩增与测序，再通过拼接比对，获得GI.Pb/GI.6型诺如病毒基因组序列。利用该引物对GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组进行扩增和测序的方法具有操作简单、周期短、成本低、灵敏度高等特点。本发明专利技术可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求的机构以及相应的科学研究领域。

【技术实现步骤摘要】
一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法
：本专利技术属于生物
，具体涉及一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。
技术介绍
：诺如病毒是全球急性胃肠炎的重要非细菌性病原，可感染各年龄段人群。目前每年在全球各地会发生约6.8亿人次的诺如病毒感染，在发展中国家还引起了20万例以上的5岁以下儿童死亡，增加了至少42亿美元的治疗成本以及造成603亿美元的社会经济损失。随着我国食品安全监管体制及公共卫生系统的改善，近年来诺如病毒在许多省市被发现是引起群体中毒的主要食源性病原，对食品安全和公共卫生工作造成了极大威胁。然而合适感染模型的长期缺乏阻碍了对这种病毒的全面认识，至今仍没有有效的病毒防控策略和抗病毒手段。诺如病毒根据其衣壳蛋白VP1的氨基酸序列，可以被分为六个基因组(Genogroup)GI-GVI，其中GI、GII和GVI可以感染人类。同一基因组内的诺如病毒还可以进一步分成不同的基因型，例如GI包括了至少9种基因型，GII包括了22种基因型。GII.4型诺如病毒是全球的主要流行基因型，约80％的诺如病毒感染是由该型别毒株引起的。然而，其他基因型也在病毒监测过程中被发现，尤其在水体环境中具有更广泛的多样性分布，多种GI基因型毒株被报道。但这些非主要流行基因型则较少被关注，因此，加强不同基因型诺如病毒的信息收集工作具有重要意义。近年来，尽管人源诺如病毒体外培养方面的研究有了突破性进展，但是合适的复制体系仍然缺乏；尤其是诺如病毒极易变异，因此，持续监测病毒流行水平及变异情况仍是认识病毒的重要基础。基因组信息的获得为诺如病毒研究提供了重要的基础数据。诺如病毒基因组长约7.5-7.8kb，包括3个开放阅读框。我们前期工作中针对GII.4型、GII.17型诺如病毒以及GII.P12/GII.3重组型诺如病毒建立的“4+1+1”扩增策略具有操作简单、周期短、成本低以及灵敏度高的特点，因此，根据这种新颖的扩增策略，我们研发了一种针对GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒的基因组扩增引物和扩增方法，为积累我国GI型诺如病毒基因组资源提供了一个有力的研究工具。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。具体地，本专利技术提供的GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物，包括六对扩增引物和两条测序引物：引物对1：I-1F：5'-GTGAATGATGATGGCGTC-3'；I.b-1R：5'-GCAGAGAGTTTTCTAGCTTT-3'；引物对2：I.b-2F：5'-TAGCCATTGGATTTACCAG-3'；I.b-2R：5'-CTCAGTCTCACATAGTCCA-3'；引物对3：I.b-3F：5'-AAGAACACAAGTGCAAAGTCC-3'；I.b-3R：5'-GACATGCATCACTGTAACTCCA-3'；引物对4：I.b-4F：5'-AAGCCATTTGCTGAGCCAC-3'；G1SKR：5'-CCAACCCARCCATTRTACA-3'；引物对5：G1SKF：5'-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3'；I.6-5R：5'-CATTATATACGCCGCAATCC-3'；引物对6：I.6-6F：5'-CGACATCATAGGTAGCCTT-3'；I.6-6R：5'-AAATCTGAATATGGTGCCCAC-3'；测序引物：I.b-seq1R：5'-GCTGGTTCCATATTCCTTAGGTC-3'；I.6-seq6F：5'-GGTCTCCAGGCTCAACGGTA-3'；R代表A/G，Y代表C/T。本专利技术还提供一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增方法，具体为：分别以上述的引物对I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R作为扩增引物的上下游引物，以GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后采用以上每对扩增引物以及两条测序引物I.b-seq1R、I.6-seq6F分别对相对应的扩增产物进行核酸序列测定，再拼接比对，获得GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒的基因组全长序列。进一步地，所述的RT-PCR，其反应体系为：含有2×one-stepRT-PCRmixture10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，RNA模板2μL，其余由双蒸水补足至20μL，反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，60℃30s，72℃75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术针对常见的GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因型，采用覆盖整个基因组的“4+1+1”的分段扩增策略，通过应用于实际检出样本的扩增、测序及序列拼接，获得了GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组序列。利用该引物进行GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组序列扩增和测序的方法具有操作简单、周期短、成本低、灵敏度高等特点。本专利技术可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求的机构以及相应的科学研究领域。附图说明：图1为GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增策略与相应引物的设计位置。图2为适用于GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR退火温度优化，电泳顺序为M，1-28。其中M为DNALadder，1-4、5-8、9-12、13-16、17-20、21-24、25-28分别为基因组扩增引物I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R和检测引物G1SKF/G1SKR在不同退火温度(依次为45℃、50℃、55℃、60℃)下扩增产物的电泳结果。图3为适用于GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增的RT-PCR引物浓度优化，图A-图F分别为引物I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-3F/I.b-3R、I.b-4F/G1SKR、G1SKF/I.6-5R、I.6-6F/I.6-6R的优化结果，电泳顺序为M，1-9，其中M为DNALadder，1-3为0.2μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果，4-6为0.6μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果，7-9为1.0μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果。图4为GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏度评价，电泳顺序为M，1-35，其中M为DNALadder，1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35分别为基因组扩增引物I-1F/I.b-1R、I.b-2F/I.b-2R、I.b-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物和两条测序引物：引物对1：I‑1F：5'‑GTGAATGATGATGGCGTC‑3'；I.b‑1R：5'‑GCAGAGAGTTTTCTAGCTTT‑3'；引物对2：I.b‑2F：5'‑TAGCCATTGGATTTACCAG‑3'；I.b‑2R：5'‑CTCAGTCTCACATAGTCCA‑3'；引物对3：I.b‑3F：5'‑AAGAACACAAGTGCAAAGTCC‑3'；I.b‑3R：5'‑GACATGCATCACTGTAACTCCA‑3'；引物对4：I.b‑4F：5'‑AAGCCATTTGCTGAGCCAC‑3'；G1SKR：5'‑CCAACCCARCCATTRTACA‑3'；引物对5：G1SKF：5'‑CTGCCCGAATTYGTAAATGA‑3'；I.6‑5R：5'‑CATTATATACGCCGCAATCC‑3'；引物对6：I.6‑6F：5'‑CGACATCATAGGTAGCCTT‑3'；I.6‑6R：5'‑AAATCTGAATATGGTGCCCAC‑3'；测序引物：I.b‑seq1R：5'‑GCTGGTTCCATATTCCTTAGGTC‑3'；I.6‑seq6F：5'‑GGTCTCCAGGCTCAACGGTA‑3'；R代表A/G，Y代表C/T。...

【技术特征摘要】
1.一种GI.Pb/GI.6重组型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物和两条测序引物：引物对1：I-1F：5'-GTGAATGATGATGGCGTC-3'；I.b-1R：5'-GCAGAGAGTTTTCTAGCTTT-3'；引物对2：I.b-2F：5'-TAGCCATTGGATTTACCAG-3'；I.b-2R：5'-CTCAGTCTCACATAGTCCA-3'；引物对3：I.b-3F：5'-AAGAACACAAGTGCAAAGTCC-3'；I.b-3R：5'-GACATGCATCACTGTAACTCCA-3'；引物对4：I.b-4F：5'-AAGCCATTTGCTGAGCCAC-3'；G1SKR：5'-CCAACCCARCCATTRTACA-3'；引物对5：G1SKF：5'-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3'；I.6-5R：5'-CATTATATACGCCGCAATCC-3'；引物对6：I.6-6F：5'-CGACATCATAGGTAGCCTT-3'；I.6-6R：5'-AAATCTGAATATGGTGCCCAC-3'；测序引物：I.b-seq1R：5'-GCTGGTTCCATATTCCTTAGGTC-3'；I.6-seq6F：5'-...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亮，吴清平，张乐，蔡伟程，蔡淑珍，张菊梅，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，广东环凯微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44