本发明专利技术公开一种鉴别红鳍东方鲀个体性别的SNP分子标记，其特征在于DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述序列中第121位点及第262位点的碱基N为C或G。鉴别方法按如下步骤进行：以红鳍东方鲀基因组DNA为模板，以上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得PCR产物；所述上游引物和下游引物的DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；对所得到的PCR产物进行测序，所测DNA序列的第121个碱基处和第262个碱基处同时为双峰的个体即为红鳍东方鲀雄鱼，所测DNA序列序列的第121个碱基处和第262个碱基处同时为单峰的个体即为红鳍东方鲀雌鱼。
Identification of individual sex of Fugu redfin by SNP markers and identification methods
The present invention discloses a SNP molecular marker for identifying individual sex of red-finned Oriental puffer. The SNP molecular marker is characterized by DNA sequence as shown in SEQ ID NO:1, in which the base N of locus 121 and 262 is C or G. The identification method was carried out in the following steps: using genomic DNA as template, the upstream and downstream primers were amplified by PCR to obtain the PCR products; the DNA sequences of the upstream and downstream primers were shown as SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3, respectively; the obtained PCR products were sequenced, and the 121 DNA sequence was determined. The individual with double peaks at the base and 262 bases is male red-fin Oriental puffer. The individual with single peak at the 121st base and 262nd base is female red-fin Oriental puffer.
【技术实现步骤摘要】
鉴别红鳍东方鲀个体性别的SNP分子标记及鉴别方法
本专利技术涉及一种鉴别红鳍东方鲀个体性别的SNP分子标记及鉴别方法，尤其是一种同时获得雌、雄判定结果、操作简便、可提高鉴别准确性的鉴别红鳍东方鲀个体性别的SNP分子标记及鉴别方法。
技术介绍
红鳍东方鲀（Takifugurubripes）是我国北方沿海重要的海水养殖经济鱼类，其肉味鲜美，营养丰富，深受东亚各国消费者的青睐。我国每年红鳍东方鲀的养殖产量可达5000多吨，人工繁殖、育苗、养成技术基本成熟，但在种质资源、新品种创制等方面，与产业的需求还有较大的差距，亟待摸清自然海域红鳍东方鲀的群体资源状况及养殖群体的遗传结构,亟待解决由于近亲繁殖而出现的疾病频发、生长速度缓慢的遗传衰退现象。在红鳍东方鲀品种改良、新品种培育上，需要准确判别种鱼的性别。但是红鳍东方鲀雄鱼在3龄以上、雌鱼在4龄以上才能性成熟，在性成熟的排精和产卵之前，雌鱼和雄鱼在体型外貌上难以鉴别。单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）是指基因组DNA上由单个核苷酸突变所引起的DNA序列多态性，通过确定SNP与性别基因及雌、雄性别的紧密连锁，可以在生物体任何生长发育阶段鉴别其个体的性别。TakashiKamiya,等，PlosGenetics,2012,8(7):e1002798，已证实红鳍东方鲀位于Amhr2基因的第7271位点为红鳍东方鲀的性别判定位点，但是以此单个位点鉴别红鳍东方鲀个体性别存在着准确度较低的问题。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的问题，提供一种同时获得雌、雄判定结果、操作简便、可提高鉴别准确性的鉴别红鳍东方鲀个体性别的SNP分子标记及鉴别方法。本专利技术的技术解决方案是：一种鉴别红鳍东方鲀个体性别的SNP分子标记，其特征在于DNA序列如SEQIDNO:1所示，所述序列中第121位点及第262位点的碱基N为C或G。一种用上述鉴别红鳍东方鲀个体性别的SNP分子标记及鉴别方法，其特征在于按如下步骤进行：a.提取待鉴别红鳍东方鲀性别个体的基因组DNA；b.用得到的基因组DNA为模板，以上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得PCR产物；所述上游引物和下游引物的DNA序列分别如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示；c.对所得到的PCR产物进行测序，所测DNA序列的第121个碱基处和第262个碱基处同时为双峰（套峰）的个体即为红鳍东方鲀雄鱼，所测DNA序列序列的第121个碱基处和第262个碱基处同时为单峰的个体即为红鳍东方鲀雌鱼。本专利技术发现了红鳍东方鲀如SEQIDNO:1所示DNA序列第121位点的SNP为新位点，与第262个位点SNP一一对应，相关性系数R2=1，测序峰图完全一致且与红鳍东方鲀的性别完全吻合（第262位点的SNP已被证明与红鳍东方鲀的雌雄紧密连锁），进而专利技术以第121位点的SNP为分子标记对红鳍东方鲀个体性别进行鉴定，可同时获得雌、雄判定结果、操作简便，提高了鉴别的准确性。附图说明图1是本专利技术实施例两个SNPs位点处的测序峰图。具体实施方式本专利技术实施例的鉴别方法按照如下步骤进行：a.提取待鉴别红鳍东方鲀性别个体的基因组DNA；a.1红鳍东方鲀群体的获得所采用的鉴别性别的个体为大连、河北等地不同养殖场不同红鳍东方鲀家系的红鳍东方鲀，随机选择252个个体，剪取少许尾鳍鳍条于80%乙醇中，在-20℃冰箱中保存，用于基因组DNA的提取。a.2红鳍东方鲀基因组DNA提取采用常规酚仿法抽提红鳍东方鲀鳍条中的基因组DNA，具体步骤如下：（1）取红鳍东方鲀尾鳍组织100~120mg于1.5毫升的离心管中，并用眼科剪尽量将其剪碎（粉末状）；（2）向已剪碎尾鳍的离心管中加入700μLDNA提取液；（3）加蛋白酶K（20mg/ml）5μL，轻轻混匀，放入55℃水浴中消化2~4小时；（4）将溶液冷却至室温，加等体积苯酚，抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；（5）取上清加入一新的1.5ml离心管中，加等体积酚仿抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；（6）取上清加入一新的1.5ml离心管中，加等体积氯仿抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；（7）取上清加入一新的离心管中，加1/5体积3molNaAc（PH5.2）和2倍体积无水乙醇，12000rpm离心5分钟；（8）弃掉无水乙醇溶液，用70%乙醇洗沉淀2次，5000rpm离心5分钟；（9）弃掉乙醇，室温放置10~20分钟，用100μLTE溶解沉淀DNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA，DNA溶液于-4℃或-20℃保存备用。b.用SEQIDNO:2所示上游引物F和SEQIDNO:3所示下游引物R，对上述提取的红鳍东方鲀的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为25μl，反应程序为：10pmol/L的SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的上下游引物各1μl，30-200ng/μl的模板DNA1μl，10mmol/L的dNTPmix2.0μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.5μl，余量为双蒸水；该PCR扩增的反应条件为：94℃4分钟；94℃25秒，55℃25秒，72℃30秒，32个循环；72℃7分钟。c.按照现有技术的方法（如ABI3730测序仪）对所得到的252个体的PCR产物进行测序，均具有SEQIDNO.1所示DNA序列且自5′端起第121位点处、第262位点处同时为单峰或双峰的测序峰图，如图1所示。图1中A：第121位点与第262位点同时出现双峰的则为红鳍东方鲀雄鱼♂，B：第121位点与第262位点同时出现单峰的则为红鳍东方鲀雌鱼♀。测序峰图只有这两种情况。原因是这两处碱基在雌鱼和雄鱼间发生了碱基突变，即由雌鱼的碱基C突变为雄鱼的碱基G，从而导致雄鱼个体这两处的碱基出现杂合，测序时得到的峰图均为双峰。252尾红鳍东方鲀的性别鉴定结果见表1。表1红鳍东方鲀性别鉴定结果个体号PCR产物(bp)第121位点SNP峰图第262位点SNP峰图雌♀/雄♂个体号PCR产物(bp)第121位点SNP峰图第262位点SNP峰图雌♀/雄♂1562双峰双峰♂127562双峰双峰♂2562双峰双峰♂128562单峰单峰♀3562单峰单峰♀129562双峰双峰♂4562双峰双峰♂130562双峰双峰♂5562双峰双峰♂131562双峰双峰♂6562双峰双峰♂132562双峰双峰♂7562单峰单峰♀133562单峰单峰♀8562双峰双峰♂134562双峰双峰♂9562单峰单峰♀135562单峰单峰♀10562双峰双峰♂136562双峰双峰♂11562单峰单峰♀137562单峰单峰♀12562双峰双峰♂138562单峰单峰♀13562单峰单峰♀139562双峰双峰♂14562单峰单峰♀140562单峰单峰♀15562单峰单峰♀141562双峰双峰♂16562双峰双峰♂142562单峰单峰♀17562双峰双峰♂143562单峰单峰♀18562单峰单峰♀144562双峰双峰♂19562单峰单峰♀145562单峰单峰♀20562双峰双峰♂146562单峰单峰♀21562单峰单峰♀147562单峰单峰♀22562双峰双峰♂148562双峰双峰♂235本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鉴别红鳍东方鲀个体性别的SNP分子标记，其特征在于DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述序列中第121位点及第262位点的碱基N为C或G。
【技术特征摘要】
1.一种鉴别红鳍东方鲀个体性别的SNP分子标记，其特征在于DNA序列如SEQIDNO:1所示，所述序列中第121位点及第262位点的碱基N为C或G。2.一种用权利要求1所述鉴别红鳍东方鲀个体性别的SNP分子标记及鉴别方法，其特征在于按如下步骤进行：a.提取待鉴别红鳍东方鲀性别个体的基因组DNA；b.用得到的基因组DNA为模板，以上游引...
【专利技术属性】
技术研发人员：仇雪梅，王智诚，李鑫，胡子文，王秀利，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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