用于检测鸽副伤寒沙门氏菌的核酸、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种用于鸽副伤寒沙门氏菌检测的核酸、试剂盒及检测方法。本发明专利技术提供了检测鸽副伤寒沙门氏菌的引物对和用于检测沙门氏菌属的内参引物对，扩增片段大小分别为鸽副伤寒沙门氏菌为613bp和沙门氏菌属为463bp。本发明专利技术建立了一种快速准确的检测出鸽副伤寒沙门氏菌的PCR检测方法，该方法能够准确检测临床可疑菌株样品，区分其他常见致病性沙门氏菌血清型，且非沙门氏菌致病菌的扩增结果为阴性。本发明专利技术的检测方法特异性好、灵敏度高、检测时间短、操作简单和结果易于判定，对设备的要求低，仅需半天即可完成检测，对于疫情的诊断和控制具有十分重要的作用，从而最大程度地避免了经济损失及对公共健康造成的危害。

Nucleic acid, kit and detection method for detecting Salmonella pigeon paratyphoid

The invention provides a nucleic acid, reagent kit and detection method for detection of Salmonella typhimurium in pigeon. The invention provides a pair of primers for detecting Salmonella paratyphi in pigeons and an internal reference pair for detecting Salmonella. The amplified fragments are 613 BP for Salmonella paratyphi in pigeons and 463 BP for Salmonella. The invention establishes a rapid and accurate PCR detection method for detecting Salmonella paratyphi in pigeons. The method can accurately detect suspected clinical strain samples, distinguish other common pathogenic Salmonella serotypes, and the amplification result of non-Salmonella pathogenic bacteria is negative. The detection method of the invention has the advantages of good specificity, high sensitivity, short detection time, simple operation and easy judgment, low requirement for equipment, and can complete the detection in only half a day. It plays an important role in the diagnosis and control of epidemic situation, thus avoiding the economic loss and the danger to public health to the greatest extent. Harm.

【技术实现步骤摘要】
用于检测鸽副伤寒沙门氏菌的核酸、试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测鸽副伤寒沙门氏菌的核酸以及含有该核酸的试剂盒和检测方法。
技术介绍
沙门氏菌是一种重要的食源性病菌，是威胁公众卫生安全的一种重要的致病菌，有2600多个血清型，该细菌能引起各种家禽和哺乳动物的传染病，也可引起人类疾病，是一种重要的人畜共患病病原。其中鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)属于沙门氏菌B群。鼠伤寒沙门氏菌(哥本哈根变种)是鸽副伤寒病的病原菌，对幼鸽具有较强的致病性，然而，目前国内关于鸽源沙门氏菌的诊断研究较少，对该菌的检测主要依靠传统的培养方法(参见国标GB/T4789.4-2008)，该方法需经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学试验鉴定，操作步骤复杂，不利于及时诊断病因，确定病源，控制病情的蔓延。另外，沙门氏菌血清学检测仍然是通过细菌与特异性抗体的凝集反应鉴别其O抗原和H抗原，根据White-Kauffmann-LeMinor抗原表确定沙门氏菌的血清型。但该方法容易受试验人员主观因素影响，对某些血清型的鉴别容易混淆，甚至无法鉴别，必须通过常规的生化鉴定，这种常规的检测方法需要5至7天的时间，过程繁琐，耗时耗力，无法做到快速诊断和有效控制疫病，并在揭示病原菌之间联系方面存在较大缺陷。另外血清价格昂贵，在生产中难以推广应用。因此，越来越多的研究人员尝试应用新型技术进行沙门氏菌鉴定，从而使鉴定方法更加快捷而有效。PCR方法检测病原菌时具有快速、灵敏、特异等优点，因此它作为检测病原的一种方法表现出巨大的潜力。在我国，有学者先后以鼠伤寒沙门氏菌fimA、fimY、fljB等基因为目的基因，对鼠伤寒沙门氏菌进行特异性PCR检测，但是采用常规细菌分离鉴定PCR方法，操作步骤烦琐，结果准确性低。经对现有技术的文献检索发现，尚未发现与本专利技术的鸽副伤寒沙门氏菌PCR检测方法、来自鸽源的核酸序列有关报道。如何能快速、准确的检测并确诊病原是鸽副伤寒沙门氏菌病，对预防治理鸽副伤寒病有重要意义。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于检测鸽副伤寒沙门氏菌的核酸，包括有特异性引物对或/和内参引物对，用该特异性引物进行检测鸽副伤寒沙门氏菌，直接从临床样品样品中检测鸽副伤寒沙门氏菌，与细菌分离比较检测步骤少，时间短，成本低，准确性高，更加具有实用性，检测结果特异，结果判定简单。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：一组用于检测鸽副伤寒沙门氏菌的核酸，包括鸽副伤寒沙门氏菌上游引物和鸽副伤寒沙门氏菌下游引物，所述鸽副伤寒沙门氏菌上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述鸽副伤寒沙门氏菌下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。如上所述用于检测鸽副伤寒沙门氏菌的核酸，还包括用于检测沙门氏菌的内参核酸，包括内参上游引物和内参下游引物，所述内参上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。如上所述的用于检测鸽副伤寒沙门氏菌的核酸，还包括鸽副伤寒沙门氏菌阳性对照，所述鸽副伤寒沙门氏菌阳性对照含如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了用于检测鸽副伤寒沙门氏菌PCR检测试剂盒，其包括如上所述的核酸。其中，2×Premix中含有PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq酶。本专利技术还提出了使用上述试剂盒检测鸽副伤寒沙门氏菌的方法，其包括以下步骤：S1、提取待检样品基因组DNA；S2、对提取的所述基因组DNA采用如上所述的试剂盒进行PCR扩增；S3、琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸽副伤寒沙门氏菌。如上所述的方法，优选地，在步骤S3中，所述判断的方法为：如果电泳结果在463bp位置出现扩增条带，则说明样品中含有沙门氏菌；如果没有出现相应的463bp扩增条带，则样品中不含有沙门氏菌；如果电泳结果在613bp位置和463bp位置均出现扩增条带，则说明样品中含有鸽副伤寒沙门氏菌；如果没有出现相应的613bp扩增条带，则样品中不含有鸽副伤寒沙门氏菌。扩增时，可采用鸽副伤寒沙门氏菌阳性对照作为模板进行扩增，同时设置灭菌水为阴性对照进行扩增，电泳结果应是鸽副伤寒沙门氏菌阳性对照在613bp位置出现扩增条带，阴性对照没有条带出现；如果阳性对照没有在对应位置出现扩增条带或阴性对照出现非特异性条带，说明所用试剂失效或被污染，应重新配制试剂或更换，重新进行检测，设置阳性对照和阴性对照用于保证检测结果的准确性。如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，所述PCR扩增所采用的检测体系为20μL反应体系包括：2×Premix10μL，10μmol/L的上游引物、下游引物各0.5μL，模板溶液1.5μL，最后灭菌去离子水补足至20μL。如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，所述PCR扩增所采用的扩增程序为：先95℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，循环共30个；循环结束后，72℃延伸7min，降温至16℃，结束。更进一步的，本专利技术还提供了如上所述的核酸或如上所述的检测试剂盒在制备用于检测鸽副伤寒沙门氏菌试剂盒中的应用。所述的试剂用于区别鸽副伤寒沙门氏菌及其他致病性沙门氏菌血清型和其它非沙门氏菌。其中，优选地，所述的其他致病性沙门氏菌血清型包括鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌血清型；其它非沙门氏菌包括大肠杆菌。与现有检测技术相比较，本专利技术的有益效果在于：采用本专利技术提供的特异性引物用于检测鸽副伤寒沙门氏菌，内参引物对用于验证是否为沙门氏菌，其检测方法相比于其他检测方法具有明显优势。现有常规的细菌分离鉴定费时费力；平板凝集实验虽然简便，但容易出现假阳性。本专利技术建立的鸽副伤寒沙门氏菌多重PCR检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确，该方法操作简单、快速、费用低，在普通的实验室均可以进行，整个检测过程只需半天就可以完成。而且本专利技术可用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，弥补免疫检测的缺陷，更具实用性。本专利技术的检测方法还便于在基层实验室中推广使用，完全可以满足在鸽场快速、特异性检测鸽副伤寒沙门氏菌的需求，对于疫情的诊断和控制具有十分重要的作用，从而最大程度地避免了经济损失及对公共健康造成的危害。附图说明图1为本专利技术实施例1中鸽副伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法的建立凝胶电泳结果；其中，图1中：泳道1-3为鸽副伤寒沙门氏菌；泳道4-6：鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、空白对照。图2为本专利技术实施例2中鸽副伤寒沙门氏菌PCR检测方法特异性评价实验凝胶电泳结果；其中，图2中：泳道1-2：鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌；泳道M：2000bp分子量标准；泳道3-8：鼠伤寒沙门氏菌、鸽副伤寒沙门氏菌1、2、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌。图3为本专利技术实施例3中鸽副伤寒沙门氏菌PCR检测方法灵敏性评价实验凝胶电泳结果；其中，M：2000bp分子量标准；泳道1-8：DNA模板浓度分别为：39.5ng、3.95ng、395pg、39.5pg、3.95pg、395fg、39.5fg、3.95fg。图4为本专利技术实施例4中鸽副伤寒沙门氏菌疑似菌株的检测凝胶电泳结果。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于检测鸽副伤寒沙门氏菌的核酸，其特征在于，包括鸽副伤寒沙门氏菌上游引物和鸽副伤寒沙门氏菌下游引物，所述鸽副伤寒沙门氏菌上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述鸽副伤寒沙门氏菌下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于检测鸽副伤寒沙门氏菌的核酸，其特征在于，包括鸽副伤寒沙门氏菌上游引物和鸽副伤寒沙门氏菌下游引物，所述鸽副伤寒沙门氏菌上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述鸽副伤寒沙门氏菌下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，还包括用于检测沙门氏菌的内参核酸，包括内参上游引物和内参下游引物，所述内参上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，还包括鸽副伤寒沙门氏菌阳性对照，所述鸽副伤寒沙门氏菌阳性对照含如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。4.含有权利要求1-3中任一项所述核酸的检测试剂盒。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×Premix，所述2×Premix包括PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq酶。6.一种检测鸽副伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，其包括以下步骤：S1、提取待检样品基因组DNA；S2、对提取的所述基因组DNA采用根据权利要求4或5所述的检测试剂盒进行PCR扩增，获得扩增产物；S3、用琼脂糖凝胶电泳检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：张莉，陈小玲，章振华，先宏，杨兵，陈葵，许健，樊艺丹，闫伟，卢秋翰，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11