一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂制造技术

本发明专利技术提供了一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂菌群之间互利共生、协同增效，在发酵秸秆过程中可同时分泌与木质素降解相关的三种酶，其漆酶、木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶的活力分别为23.56U/g、23.02U/g和21.74U/g生物质，发酵后玉米秸秆中的木质素含量下降了60.21%，且无纤维素及半纤维素等糖类的损失。经预处理后的玉米秸秆中纤维素的转化率较未处理的玉米秸秆提高了142.14%。筛选到的复合菌株具有强木质素降解能力，经菌株预处理后的秸秆的工业化利用效率显著提升，本研究为秸秆中木质纤维素的酶解糖化提供了一种新的预处理途径。

A microorganism complex microbial agent for degradation of straw lignin

The invention provides a mutually beneficial symbiosis and synergistic synergism among microbial complex microbial agents which can efficiently degrade straw lignin. During the fermentation of straw, three enzymes related to lignin degradation can be secreted simultaneously. The activities of laccase, lignin peroxidase and manganese peroxidase are 23.56U/g, 23.02U/g and 21.74U/g, respectively. After fermentation, the lignin content of corn straw decreased by 60.21%, and there was no loss of sugar such as cellulose and hemicellulose. The conversion rate of cellulose in pretreated corn stalks increased by 142.14% compared with untreated corn stalks. The screened composite strains had strong lignin degradation ability, and the industrial utilization efficiency of straw pretreated by the strains increased significantly. This study provided a new pretreatment way for enzymatic hydrolysis and saccharification of lignocellulose in straw.

【技术实现步骤摘要】
一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂
本专利技术涉及一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂，属于农业集约化生产技术，专用于降解废弃玉米秸秆生产有机肥料，实现有机废弃物的资源化利用。
技术介绍
化学能源的短缺和日益严重的环境污染使得人们不断寻求可再生的绿色能源。木质纤维素作为一种碳中性的绿色能源因其具有丰富易得和成本低廉的优点而成为较好的绿色候选资源。基于糖平台的生物炼制技术是利用木质纤维素的有效途径。这一过程主要是将玉米秸秆、麦秆及其他木质纤维素资源转化为多糖，而后通过生物发酵的方式继续将多糖转化为其他生物基产品。其中，玉米秸秆年产量居高，但利用率尚有待提高。酶法水解可有效地将玉米秸秆中的纤维素转化为多糖。但是木质素和半纤维素以共价键形式结合将纤维素包裹其中，形成一种天然的屏障阻碍纤维素酶与纤维素分子的接触，因此限制了纤维素的分解。预处理可破坏木质素的结构，提高纤维素酶与纤维素结合，从而提高生物质的利用效率。物理、化学、生物方法均可使木质素降解。物理和化学方法可使木质含量降低约50%，然而这两种方法的成本较高，且会带来二次污染。微生物方法以其操作简单，成本低廉且对环境安全有好的特点成为研究的热点，但很多微生物只能分泌降解木质素的少数酶或者酶活性不高，导致木质素降解率较低，并且较少保留纤维素。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%，上述菌剂中：所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌（BacillusmucilaginosusKrassilnikov）GIM1.16；所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌（Laceyellatengchongensis）CCTCCAA208050Laceyella；本专利技术所述菌种均可以从中国典型培养物保藏中心（CCTCC）和广东省微生物保藏中心（GIM）购买得到。所述产漆酶疣孢漆斑菌为（Myrotheciumverrucaria）突变菌株T2901，是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的，其已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期是2017年7月5日，保藏号是CCTCCNO:M2017413。一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂的制备方法，按如下步骤：将上述菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/克。活化的培养基为PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L；将菌液按照以下质量比混合：产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%，进行充分混合获得复合菌剂。上述复合菌剂在降解秸秆中的应用。本专利技术获得的有益效果：本专利技术的所提供一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂菌群之间互利共生、协同增效，在发酵秸秆过程中可同时分泌与木质素降解相关的三种酶，其漆酶、木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶的活力分别为23.56U/g、23.02U/g和21.74U/g生物质，发酵后玉米秸秆中的木质素含量下降了60.21%，且无纤维素及半纤维素等糖类的损失。经预处理后的玉米秸秆中纤维素的转化率较未处理的玉米秸秆提高了142.14%。筛选到的复合菌株具有强木质素降解能力，经菌株预处理后的秸秆的工业化利用效率显著提升，本研究为秸秆中木质纤维素的酶解糖化提供了一种新的预处理途径。具体实施方式实施例1疣孢漆斑菌的诱变筛选（1）形态鉴定及筛选采集长白山自然保护区林区土壤，常规方法在PDA培养基上培养，菌株菌丝起初呈现白色絮状，向外周发散生长，菌落近似不规则圆形，在平板上生长5d后有分生孢子座出现，分生孢子最初呈现墨绿色，培养8d后，分生孢子颜色继续加深，并出现胶點团；培养10d后，菌落呈同心轮纹状，分生孢子胶點团呈现黑色，菌落背面出现淡褐色发射状褶皱。用打孔器打取直径为1cm的菌块，接种到苯胺蓝选择培养基上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察苯胺蓝褪色情况，挑选褪色速率快，能力强的菌株为候选菌株。同时为了定向性筛选降解木质素的菌株，设计培养基以木质素为唯一碳源的液体发酵培养基，通过单一碳源的限定，测定木质素的去除率，选择在木质素培养基中涨势良好，且对木质素有一定去除能力的菌株进行后续玉米秸秆的预处理试验。（2）菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类在确定性状稳定后将菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，鉴定结果此种菌株为疣孢漆斑菌T2901。（3）菌株的诱变及筛选突变株的制备主要采用的是常压室温等离子体诱变（ARTP）法，用疣孢漆斑菌T2901制备孢子悬浊液。而后进行稀释，调整孢子浓度为107/mL，取10µL稀释好的菌悬液滴于ARTP的载片上，进行诱变，用ARTP诱变育种系统4mm射距照射，最佳诱变时间为75s。将稀释的菌悬液均匀涂布到愈创木酚选择性培养基（愈创木酚浓度为0.4%加入PDA培养基中）上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察变色圈情况，挑选变色圈的大的菌株为候选菌株。正向突变株T2901漆酶活力较野生型菌株提升约50%，经多次传代培养，菌株T2901可稳定遗传。实施例2复合菌剂的制备一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂，该菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料：产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%，上述菌剂中：所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌（BacillusmucilaginosusKrassilnikov）GIM1.16；所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌（Laceyellatengchongensis）CCTCCAA208050Laceyella；本专利技术所述菌种均可以从中国典型培养物保藏中心（CCTCC）和广东省微生物保藏中心（GIM）购买得到。所述产漆酶疣孢漆斑菌T2901（Myrotheciumverrucaria）突变菌株T2901，保藏号是CCTCCNO:M2017413；将上述菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/克。活化的培养基为PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。将菌液按照以下质量比混合：产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%，进行充分混合获得复合菌剂。实施例3秸秆的降解采用三角瓶固体发酵的方法研究菌株对普通玉米秸秆的降解效果。每个300mL三角瓶分装烘干的、剪碎至0.5cm宽、1-2cm长的秸秆5g，(NH4)2SO40.2g，MgSO4·7H2O0.05g，每瓶加5mMpH7.0的磷酸缓冲液15mL。各瓶接种0.25mL2.0×108个/mL浓度的复合菌剂悬液，同时在对照组取等量的无菌水，混匀后置于20℃恒温培养。定期观察烟秆的形态变化，7天后洗去测定其玉米秸秆的木质素的降解率。木质素标准曲线的绘制：配制10g/L的木质素溶液，进行扫描并选择测定波长。然后再通过稀释制备浓度为10、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%。

【技术特征摘要】
1.一种高效降解秸秆木质素的微生物复合菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产漆酶疣孢漆斑菌40%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌30%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌30%。2.如权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于：所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌（Bacillusmucilagino...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈光，孙旸，苏瑛杰，苟泽昌，于潇潇，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22