一种基于PRET的磷光探针定量检测凝血酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于PRET的磷光探针特异性引物定量检测凝血酶的方法。为了提高其灵敏度，本发明专利技术在TBA上进行修饰，得到TBA‑BHQ2探针。利用水热合成法合成的磷光QDs作为能量供体，TBA‑BHQ2作为能量受体，构成磷光共振转移检测机制，导致磷光猝灭。由于凝血酶适配体与凝血酶之间有较强的结合，从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与TBA‑BHQ2混合猝灭体系中的TBA‑BHQ2离开量子点表面与凝血酶形成新的复合物，从而使体系磷光强度恢复。相对于荧光量子点，磷光量子点因其磷光寿命长、可避免自体荧光和散色光的干扰、选择性强、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，在检测中运用更加广泛和灵敏。

A method for quantitative detection of thrombin by phosphorescent probe based on PRET

The invention discloses a method for quantificationally detecting thrombin by using phosphorescent probe specific primers based on PRET. In order to improve its sensitivity, the invention is modified on TBA to obtain TBA BHQ2 probe. Phosphorescent QDs synthesized by hydrothermal synthesis were used as energy donors and TBA BHQ2 as energy acceptors to form the detection mechanism of phosphorescent resonance transfer, which led to phosphorescent quenching. Because of the strong binding between thrombin adapter and thrombin, the MPA-coated Mn-doped ZnS phosphorescent quantum dots and TBA-BHQ2 mixed quenching system TBA-BHQ2 leave the surface of the quantum dots to form a new complex with thrombin, thus restoring the phosphorescent intensity of the system. Compared with fluorescent quantum dots, phosphorescent quantum dots have many advantages, such as long phosphorescent lifetime, avoiding interference of autofluorescence and dispersive light, strong selectivity, no need to add any deoxidizer and inducer in detection, etc. They are more widely used and sensitive in detection.

【技术实现步骤摘要】
一种基于PRET的磷光探针定量检测凝血酶的方法本专利受到国家自然科学基金面上项目2137509，天津市自然科学基金青年项目（No.17JCQNJC05800）和天津师范大学博士基金项目（No.52XB1510）的资助。
本专利技术属于生物分析检测
，主要涉及一种基于PRET的磷光探针对凝血酶定量检测。
技术介绍
适配体是一种短的寡核苷酸，它可以折叠成一个独特的三维结构，它能将小的有机分子、蛋白质或细胞作为特定靶点。适配体是由上世纪90年代首次建立由指数富集(SELEX)系统演化而来的。从那以后，适配体已经成为一个值得注意的目标配体和治疗方法。一般来说，适配体的作用与抗体相似，但它在治疗应用方面有优势，特别是在肿瘤学领域。对于实体肿瘤的治疗，抗体的分子质量会阻碍其进入肿瘤的深层部位。相比之下，比抗体(150kDa)分子量小得多的适配体，其分子量通常在6~30kDa之间，能更好的进入肿瘤深层部位。重要的是，作为一种高度特异性的配体，适配体由于其体积小、化学和热稳定性好，易于修改和固定，是一种很有吸引力的诊断方法。在基于适配体的分析方法中，最常见的分子靶点之一是凝血酶（TB）。凝血酶是凝血剂级联的最后一种酶，它将纤维蛋白原转化为不溶纤维蛋白，形成纤维蛋白凝胶。凝血酶在血液中的浓度变化很大，在健康人的血液中几乎不存在。然而，在凝血过程中，它可以达到低微的浓度，甚至在早期的止血过程中也能产生低浓度的凝血酶。凝血酶在多种生命过程中扮演着重要的角色，涉及许多疾病，如血栓栓塞性疾病、炎症反应、心血管疾病和抗凝血疗法。因此，对凝血酶的敏感性检测在临床研究和诊断中具有重要意义。近年来，室温磷光（RTP）量子点（QDs）检测受到了广泛的关注，已被广泛应用于传感器，特别是生物分子传感器。由于能量转移过程为从三重态（4T1）到基态（6A1），因此，Mn掺杂的ZnSQDs在590nm处表现出较强的磷光发射。本专利技术中，用于检测凝血酶的“off-on”磷光传感系统依赖于含磷光QDs和带有BHQ2染料的特异性凝血酶适配体（BHQ2-TBA）。QDs作为能量供体，BHQ2-TBA作为能量受体，构成磷光共振转移（PRET）检测机制。本专利技术所用磷光材料与专利ZL201510230335.7（磷光量子点在生物体液和酒中选择性检测谷胱甘肽的应用）、ZL201410140175.2（一种磷光量子点Mn-ZnS的制备方法及铁形态分析中的应用）中所用一致，但是用于检测的体系的物质不一样。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服传统荧光量子点的不足，提供基于磷光量子点为探针检测凝血酶的方法。凝血酶适配体（TBA）与凝血酶之间具有较强的特异性结合，可以实现特异性检测。为了提高检测灵敏度，本专利技术在TBA上进行修饰，得到TBA-BHQ2探针。本专利技术利用水热合成法合成的磷光QDs作为能量供体，TBA-BHQ2作为能量受体，构成PRET检测机制，导致磷光猝灭。由于凝血酶适配体（TBA）与凝血酶之间有较强的结合，从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与TBA-BHQ2混合猝灭体系中的TBA-BHQ2离开量子点表面与凝血酶形成新的复合物，从而是体系磷光强度恢复。生物基质的自荧光或散射光干扰可以通过磷光量子来避免，因为当能量通过三线态传递时，磷光的寿命就会延长。此外，RTP生物传感器不需要任何脱氧剂或诱导剂，且避免复杂的预处理。本专利技术的技术目的通过下述技术方案予以实现：一种采用PRET的磷光探针选择性检测凝血酶的方法，其特征在于，按照下述步骤进行：（1）将制备的磷光QDs材料均匀分散在水溶液中配制成浓度为500mg/L的溶液作为检测体系，并使用315nm作为激发波长，测试体系在590nm处的磷光发射峰；（2）将TBA-BHQ2溶液加入到检测体系中并混合均匀，静置以确保两者的相互作用，从而形成QDs/TBA-BHQ2复合物，考察590nm处的磷光发射强度的变化情况，从而得到后面检测体系中TBA-BHQ2的最适浓度；（3）将待测溶液（TB）加入到（2）中并混合均匀，静置以确保分析物与QDs/TBA-BHQ2复合物相互作用，以形成新的TB/TBA-BHQ2，考察590nm处的磷光发射强度的变化情况；凝血酶溶解于自制生理盐水中，自制生理盐水配方为：称取0.8克氯化钠，溶解在少量高纯水中，稀释到100毫升。所使用的磷光QDs材料的晶体结构属立方晶系（图1），QDs材料的制备方法见实施例1：本专利技术同时也公开了所述的方法在用于选择性检测凝血酶方面的应用，磷光材料在315nm作为激发波长，在590nm处有较强发射峰，TBA-BHQ2作为猝灭剂，在590nm有紫外吸收，由于磷光材料的发射峰与猝灭剂的紫外吸收完美重叠，构成了一个PRET的检测机制。由于凝血酶与凝血酶适配体有较强的结合，所以本专利技术中使用凝血酶作为凝光恢复剂，随着凝血酶的加入考察体系在590nm处的磷光发射峰，基于此进行定量分析，通过磷光强度与加入的凝血酶的浓度进行线性拟合得到线性方程，以此来检测样品中凝血酶的含量。本专利技术基于PRET的磷光探针选择性检测凝血酶的方法，按如下步骤进行：1）将称取的制备的磷光QDs材料均匀分散在水溶液中，作为检测体系，在315nm激发波长下考察590nm处的磷光发射光谱。2）向配制好的磷光QDs材料的溶液中加入TBA-BHQ2溶液静置以确保两者充分作用，考察519nm处的磷光发射强度的变化情况，从而得到后面检测体系中TBA-BHQ2的最适浓度；3）待测溶液（TB）加入到2）中并混合均匀，静置以确保分析物与QDs/TBA-BHQ2复合物相互作用，以形成新的TB/TBA-BHQ2，考察590nm处的磷光发射强度的变化情况；将不同浓度的凝血酶溶液加入到具有磷光发射的QDs探针溶液中，590nm处的磷光强度与0.08-7.5nmol/L浓度范围内凝血酶的浓度呈良好的线性关系，线性相关系数R2=0.990，线性方程为：P0-P=281.75–10.04C，C是以nmol/L表示的凝血酶的浓度，实现对凝血酶的磷光检测。在测试过程中，向磷光QDs材料的溶液中加入TBA-BHQ2，混合均匀后，静置10-80min以使其作用完全，优选60min即可；将待测溶液（TB）加入到QDs/TBA-BHQ2复合物相互作用，静置10-80min以使其作用完全，优选60min即可。在测试过程中，将配置的一系列的生物分子溶液如L-半胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苏氨酸、溶菌酶加入2）中进行磷光测试，考察其选择性识别能力。附图说明图1为Mn掺杂ZnS磷光量子点的XRD图；图2为MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点和MPA的傅里叶变换红外光谱图（FTIR）图；图3为Mn掺杂ZnS磷光量子点的TEM图；图4为Mn掺杂ZnS磷光量子点和TBA-BHQ2的紫外光谱图和磷光发射图（aMn掺杂ZnS磷光量子点的紫外吸收，bMn掺杂ZnS磷光量子点的磷光发射图，cTBA-BHQ2的紫外吸收）；图5为加入不同浓度TBA-BHQ2加入MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点后的磷光猝灭优化图；图6是不同的浓度的凝血酶加入到对本专利技术制备的磷光探针中的磷光发射光谱图；图7是本专利技术中使用磷光探针检测凝血酶线性拟合图，在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PRET的磷光探针特异性引物定量检测凝血酶的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）将制备的磷光QDs材料均匀分散在水溶液中配制成浓度为500 mg/L的溶液作为检测体系，并使用315 nm作为激发波长，测试体系在590 nm处的磷光发射峰；所述的磷光QDs材料指的是MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点；（2）将TBA‑BHQ2溶液加入到检测体系中并混合均匀，静置以确保两者的相互作用，从而形成QDs/TBA‑BHQ2复合物，考察590 nm处的磷光发射强度的变化情况，从而得到后面检测体系中TBA‑BHQ2的最适浓度0.1 μmol/L；（3）将待测凝血酶溶液TB加入到步骤（2）中并混合均匀，静置以确保分析物与QDs/TBA‑BHQ2复合物相互作用，以形成新的TB/TBA‑BHQ2复合物，考察590 nm处的磷光发射强度的变化情况；（4）以步骤（2）对磷光量子点探针的磷光进行猝灭，以步骤（3）对量子点的磷光进行恢复，并以其对步骤（1）的磷光恢复响应值为检测信号，检测样品中凝血酶的浓度；（5）分别将不同生物分子加入加到步骤（2）中，混合均匀，静置待反应体系稳定后，进行磷光测试，考察其选择性识别能力；所述的不同生物分子指的是L‑半胱氨酸、甘氨酸、L‑组氨酸、L‑亮氨酸、L‑蛋氨酸、L‑苏氨酸或溶菌酶。...

【技术特征摘要】
1.一种基于PRET的磷光探针特异性引物定量检测凝血酶的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）将制备的磷光QDs材料均匀分散在水溶液中配制成浓度为500mg/L的溶液作为检测体系，并使用315nm作为激发波长，测试体系在590nm处的磷光发射峰；所述的磷光QDs材料指的是MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点；（2）将TBA-BHQ2溶液加入到检测体系中并混合均匀，静置以确保两者的相互作用，从而形成QDs/TBA-BHQ2复合物，考察590nm处的磷光发射强度的变化情况，从而得到后面检测体系中TBA-BHQ2的最适浓度0.1μmol/L；（3）将待测凝血酶溶液TB加入到步骤（2）中并混合均匀，静置以确保分析物与QDs/TBA-BHQ2复合物相互作用，以形成新...

【专利技术属性】
技术研发人员：李妍，熊艳，邱蕊，张菲，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津,12