金黄色葡萄球菌检测膜和制备方法及其细菌检测的方法技术

本发明专利技术涉及一种金黄色葡萄球菌检测膜和制备方法及其细菌检测的方法，属于生物检测技术领域。该检测膜包含基材层，它还包括检测层，检测层设置在基材层上，基材层为纳米纤维膜组成，检测层为氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物及苯硼酸聚合物组成，氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物和苯硼酸聚合物通过层层自组装的方式均匀交替组装设置在纳米纤维膜表面。该检测膜不仅成本低，而且可定量式对金黄色葡萄球菌进行专一性检测。

Staphylococcus aureus detection film, preparation method and bacterial detection method thereof

The invention relates to a Staphylococcus aureus detection membrane, a preparation method and a bacterial detection method, belonging to the technical field of biological detection. The detection layer consists of a substrate layer and a detection layer. The detection layer is arranged on the substrate layer. The substrate layer is composed of nano-fiber membrane, the detection layer is composed of fluoroboron fluorescent molecular functionalized glycopolymer and phenylboronic acid polymer, and the fluoroboron fluorescent molecular functionalized glycopolymer and phenylboronic acid polymer pass through the layer. The self assembly layer is assembled alternately on the nanofiber membrane surface. The detection membrane is not only low in cost, but also can be used for quantitative detection of Staphylococcus aureus.

【技术实现步骤摘要】
金黄色葡萄球菌检测膜和制备方法及其细菌检测的方法
本专利技术涉及金黄色葡萄球菌的检测，属于生物检测
，具体地涉及一种金黄色葡萄球菌检测膜和制备方法及其检测方法。
技术介绍
感染性疾病是全球第二大引起人类死亡的主要原因，而金黄色葡萄球菌(SAU)是引起人类感染的主要病原体，可引起多中国类型的感染：如皮肤软组织感染、眼眶蜂窝组织炎、坏死性筋膜炎、坏死性肺炎、心内膜炎、骨髓炎和败血症等，自1961年耐甲氧西林金黄色葡萄球菌出现以来，目前，在全球范围内已成为医院和社区获得性感染的重要起因。由于金黄色葡萄球菌对营养要求不高，且具备高度的耐盐性，容易污染肉类、水产品、乳品等食品，包括中国在内的多个国家均将金黄色葡萄球菌作为食品卫生标准的常规检查项目之一。目前为止尚未有研究能明确的表明金黄色葡萄球菌产毒与其菌数的定量联系，故无法得知金黄色葡萄球菌菌数水平与产毒之间的关系。国外通常采用食物中菌数含量达到103CFU/g作为金黄色葡萄球菌定量风险评估标准，我国食品中金黄色葡萄球菌检验按照GBT4789.10-20010执行，其中定量检验是第二法金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数和第三法金黄色葡萄球菌MPN计数，试验研究表明，单纯的采用上述两种方法，会由于人员差异引起测量结果的准确度。菌落总数测试片(PetrifilmTM)是在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后，所得每g(ml)检样中形成的微生物菌落总数，该测试片能应用于所有的食品，但主要用于评估大多数食品的总的细菌含量水平。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种成本低且定量检测金黄色葡萄球菌检测膜和制备方法及其细菌检测的方法。为实现上述目的，本专利技术公开了一种金黄色葡萄球菌检测膜，包含基材层，它还包括检测层，所述检测层设置在所述基材层上，所述基材层为纳米纤维膜组成，所述检测层为氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物及苯硼酸聚合物组成，所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物和苯硼酸聚合物通过层层自组装的方式均匀交替组装设置在所述纳米纤维膜表面，所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物为葡萄糖基化合物和氟硼荧类荧光分子的共聚物，其分子结构式如下式I所示，具体制备过程为葡萄糖单体与氟硼荧类荧光分子在偶氮二异丁腈在引发下进行自由基聚合反应；所述苯硼酸聚合物为3-丙烯酰胺基苯硼酸与甲基丙烯酸聚乙二醇酯的共聚物；所述苯硼酸聚合物的分子结构式如式II所示；上述式I中的n占90～95％，m占5～10％，n:m＝9:1～19:1，即将氟硼荧类荧光分子与葡萄糖基化合物看成为总量为1，优选n:m＝10:1、n:m＝11:1、n:m＝12:1、n:m＝13:1、n:m＝14:1、n:m＝15:1、n:m＝16:1、n:m＝17:1、n:m＝18:1；保证在对金黄色葡萄球菌的高精度识别基础上，分子的荧光强度较强，提高检测仪器的灵敏度。上述式II中，m占50～60％，n占40～50％，即m:n＝1:1～3:2，将3-丙烯酰胺基苯硼酸分子与甲基丙烯酸聚乙二醇酯看成为总量为1，在此基础上，优选，m:n＝1:1.1、m:n＝1:1.2、m:n＝1:1.3、m:n＝1:1.4；其中，式II中的3-丙烯酰胺基苯硼酸分子起到和糖基分子特异性结合的作用，较低的比例无法达到特异性结合作用，同时，3-丙烯酰胺基苯硼酸分子的水溶性较差，和甲基丙烯酸聚乙二醇酯共聚可以通过甲基丙烯酸聚乙二醇酯起到增强溶解度的作用。式II中的m和n在上述比例下既可以达到较好的特异性结合能力，又能保证在水溶液中的溶解和分散能力较好。同时，上述式II中的m和n只是编号，它还可为a、b、c、d等。进一步地，所述层层自组装的作用力为静电吸附作用力，所述纳米纤维膜表面通过静电作用力吸附氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物分子的一端，所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物分子的另一端通过静电作用力吸附苯硼酸聚合物分子。再进一步地，所述纳米纤维膜为聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维膜，所述聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维膜的厚度为100～300μm，克重为12～40gsm。为了更好的实现本专利技术的目的，本专利技术还公开了制备上述金黄色葡萄球菌检测膜的方法，包括如下步骤：1)制备纳米纤维膜：在普通无纺布的表面均匀喷淋聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维悬浮液，成膜后干燥，分离即制备得到聚乙烯醇-聚乙烯的纳米纤维膜；2)制备表面活化的纳米纤维膜：将所述步骤1)制备得到的纳米纤维膜浸渍在氢氧化钠溶液中一段时间，即得到表面活化的纳米纤维膜；3)制备细菌检测膜：将所述步骤2)制备得到的表面活化的纳米纤维膜浸渍于氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物水溶液中一段时间后，取出并采用清水洗净后，再置于苯硼酸聚合物水溶液中浸渍处理一段时间，取出并采用清水洗净，依次交替重复五次浸渍在氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物水溶液和苯硼酸聚合物水溶液中，最后干燥即制备得到细菌检测膜。进一步地，所述步骤3)中，所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物的水溶液浓度为1～4g/L，浸渍处理时间为10～30min。再进一步地，所述步骤3)中，所述苯硼酸聚合物的水溶液浓度为1～4g/L，浸渍处理时间为10～30min。更进一步地，所述步骤2)中，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5～4.5mol/L，浸渍处理的时间为10～30min。作为本专利技术的技术优选，所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物的水溶液浓度为2～3g/L，优选为3g/L，浸渍处理时间为20min；所述苯硼酸聚合物的水溶液浓度为2～3.5g/L，优选为2.5g/L，浸渍处理时间为20min；所述氢氧化钠溶液的浓度为1.5～3mol/L，优选为2mol/L，浸渍处理的时间为20min。为了进一步地实现本专利技术的目的，本专利技术还公开了一种检测金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：a)选用上述制备的检测膜并测定其表面的荧光强度值；b)取待测样品滴加到所述步骤a)选用的检测膜上；c)分别在相等的时间间隔之间测定检测膜表面的荧光强度变化值，并根据荧光强度变化值计算荧光强度的变化速率；d)根据所述步骤c)荧光强度的变化速率，结合标准曲线得到待测样品中的细菌浓度。进一步地，所述步骤d)中标准曲线的绘制过程为：取五份金黄色葡萄球菌悬浮液的浓度为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL的标准溶液，然后取5个完全相同的所述步骤a)的检测膜并测定其荧光强度值，再分别浸渍于上述标准溶液中，分别在相等的时间间隔之间测定检测膜表面的荧光强度值，由多个前后变化的荧光强度的差值计算荧光强度的变化速率，以荧光强度的变化速率为纵坐标，以对应的标准溶液浓度的对数值为横坐标，得到标准曲线。本专利技术细菌检测膜的制备原理：本专利技术的制备方法为将纳米纤维膜置于碱性溶液中，其中纳米纤维膜表面在碱性溶液中进行活化处理，使表面羟基更多的暴露在环境中，氟硼荧类荧光分子功能化的葡萄糖基聚合物利用氢键相互作用吸附在纳米纤维膜表面；再利用葡萄糖和硼酸间的相互作用使苯硼酸和甲基丙烯酸聚乙二醇酯聚合物吸附在纳米纤维膜表面，多次重复上述过程即可得到一种金黄色葡萄球菌专用检测膜。本专利技术细菌检测膜的检测原理：金黄色葡萄球菌表面带有可被葡萄糖基聚合物专一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金黄色葡萄球菌检测膜，包含基材层，其特征在于：它还包括检测层，所述检测层设置在所述基材层上，所述基材层为纳米纤维膜组成，所述检测层为氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物及苯硼酸聚合物组成，所述纳米纤维膜的表面通过静电作用力依次交替吸附所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物和苯硼酸聚合物若干次，得到金黄色葡萄球菌检测膜；所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物为葡萄糖基聚合物和氟硼荧类荧光分子的共聚物，其分子结构式如下式I所示，所述苯硼酸聚合物为3‑丙烯酰胺基苯硼酸与甲基丙烯酸聚乙二醇酯的共聚物；

【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌检测膜，包含基材层，其特征在于：它还包括检测层，所述检测层设置在所述基材层上，所述基材层为纳米纤维膜组成，所述检测层为氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物及苯硼酸聚合物组成，所述纳米纤维膜的表面通过静电作用力依次交替吸附所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物和苯硼酸聚合物若干次，得到金黄色葡萄球菌检测膜；所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物为葡萄糖基聚合物和氟硼荧类荧光分子的共聚物，其分子结构式如下式I所示，所述苯硼酸聚合物为3-丙烯酰胺基苯硼酸与甲基丙烯酸聚乙二醇酯的共聚物；2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌检测膜，其特征在于：所述式I中，n:m＝9:1～19:1。3.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌检测膜，其特征在于：所述纳米纤维膜的表面吸附所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物的一端，所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物的另一端通过静电作用力吸附所述苯硼酸聚合物；依次交替吸附所述氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物和苯硼酸聚合物各5次。4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌检测膜，其特征在于：所述纳米纤维膜为聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维膜，所述聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维膜的厚度为100～300μm，克重为12～40gsm。5.一种权利要求1所述的金黄色葡萄球菌检测膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)制备纳米纤维膜：在普通无纺布的表面均匀喷淋聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维悬浮液，成膜后干燥，分离即制备得到聚乙烯醇-聚乙烯的纳米纤维膜；2)制备表面活化的纳米纤维膜：将所述步骤1)制备得到的纳米纤维膜浸渍在氢氧化钠溶液中活化处理得到表面活化的纳米纤维膜；3)制备细菌检测膜：将所述步骤2)制备得到的表面活化的纳米纤维膜浸渍于氟硼荧类荧光分子功能化的糖基聚合物水溶液处理，取出并采用清水洗净...

【专利技术属性】
技术研发人员：王栋，鲁振坦，余振国，张佳琪，赵青华，
申请(专利权)人：武汉纺织大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42