The invention discloses a method for detecting biological activity of bovine interferon alpha and its application. The method includes the following steps: obtaining the Mxp gene fragment of bovine Mx protein by PCR amplification; removing pCMV of pEGFP N1 vector plasmid; replacing pCMV of original pEGFP N1 vector plasmid with Mxp gene fragment of bovine Mx protein by T4DNA ligase; constructing pEGFP N1 Mxp plasmid; and using pEGFP N1 Mxp plasmid. The stable transfected cell lines were screened out by neomycin. The stable transfected cell lines were cloned and cultured, and then co-incubated with the stable transfected cell lines after cloning with bovine interferon-alpha. The activity of Mx gene promoter was activated to promote the expression of EGFP in cells, and the cells were irradiated by light source. The intensity of fluorescence is positively correlated with the biological activity of bovine interferon alpha, so the biological activity of bovine interferon alpha can be quantitatively evaluated.
【技术实现步骤摘要】
一种牛干扰素α生物学活性检测方法
本专利技术涉及一种牛干扰素α生物学活性检测方法,属于干扰素活性检测
技术介绍
干扰素(IFN)是细胞和机体受到病毒感染,或者受核酸、细菌内毒素和促细胞分裂素等的作用后,由受体细胞分泌的一种广谱抗病毒糖蛋白。根据干扰素的来源和理化性质,可将其分为I型、II型和III干扰素。I型干扰素包括IFN-α,IFN-β,和IFN-τ;II型干扰素即IFN-γ;III干扰素即IL-28A,IL-28B和IL-29。IFN-α有四个主要功能。第一,可以使感染病毒的细胞及其周围细胞进入内源性抗病毒状态,限制病毒的传播;第二,维持天然免疫反应处于平衡状态,促进抗原递呈和NK细胞功能的同时抑制促炎信号通路和细胞因子的产生;第三,激活获得性免疫系统,促进高亲和力抗原特异性T细胞的产生,促进B细胞反应和免疫记忆;第四,具有抑制病毒增殖的作用。IFN-α的作用机制在25年前已经阐明,IFN与受体结合激活受体相关JAK1和TYK2,使STAT1和STAT2络氨酸磷酸化,磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚体并转移入核,装配IFN调节因子9(IRF9)形成3聚体的IFN刺激因子3(ISGF3)。ISGF3与其同源DNA序列(IFN刺激反应元件,ISREs)结合,直接激活ISGs转录,使宿主细胞进入抗病毒状态。ISG抑制病毒的途径主要有,抑制病毒的转录、翻译和核酸复制;降解病毒核酸;改变宿主细胞脂代谢。因此,只要检测到ISGs的启动子活性增加就可以直接反应IFN-α的生物学活性。IFN-α可以经JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子(Mxp ...
【技术保护点】
1.一种牛干扰素α生物学活性检测方法,其包括以下步骤:采用PCR扩增获取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段;用PCR扩增获得的牛Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP‑N1载体质粒中的pCMV的基因片段,构建pEGFP‑N1‑Mxp质粒;用pEGFP‑N1‑Mxp质粒转染细胞,并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株;对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养;以梯度稀释的牛干扰素α标准品制备标准曲线,确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系;将待检牛干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中,然后检测荧光强度,结合标准曲线评价待检牛干扰素α样品的效价。
【技术特征摘要】
2017.12.05 CN 20171126426141.一种牛干扰素α生物学活性检测方法,其包括以下步骤:采用PCR扩增获取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段;用PCR扩增获得的牛Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段,构建pEGFP-N1-Mxp质粒;用pEGFP-N1-Mxp质粒转染细胞,并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株;对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养;以梯度稀释的牛干扰素α标准品制备标准曲线,确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系;将待检牛干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中,然后检测荧光强度,结合标准曲线评价待检牛干扰素α样品的效价。2.根据权利要求1所述的牛干扰素α生物学活性检测方法,其特征在于,采用PCR扩增获取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段的步骤包括:根据Genebank中已公布的牛Mx蛋白的基因序列,选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域,设计PCR引物,进行PCR扩增;然后通过双酶切后,再通过切胶回收纯化获得Mxp的基因片段。3.根据权利要求1所述的牛干扰素α生物学活性检测方法,其特征在于,用PCR扩增获得的牛Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段,构建pEGFP-N1-Mxp质粒的步骤包括:去除pEGFP-N1载体质粒的pCMV的基因片段;通过T4DNA连接酶用Mxp的基因片段替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段,构建重组质粒pEGFP-N1-Mxp;...
【专利技术属性】
技术研发人员:张振韬,蒋敏之,单雪芹,凡玉芳,王亚男,徐文俊,许高涛,
申请(专利权)人:芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司,
类型:发明
国别省市:安徽,34
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。