三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法技术

三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法，属于生物传感器制备领域。包括步骤：1)确定待检测miRNA，并遵循序列互补原则设计发卡探针；2)在玻碳电极表面电沉积氧化石墨烯；3)1‑芘丁酸‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯(PASE)与亚甲基蓝(MB)同时竞争吸附在电还原氧化石墨烯表面；4)3‑叠氮基‑1‑正丙胺(3‑Azido‑1‑PrA)与PASE发生酰胺反应，将电极表面叠氮化；5)合成Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记的电化学发光探针Ru‑DNA；6)Ru‑DNA发生点击化学反应组装到电极表面。7)当目标miRNA存在时，阻碍发光物质Ru(bpy)2(dcbpy)NHS与淬灭剂MB之间共振能量转移的发生，引起电化学发光信号强度改变。本发明专利技术可实现对目标miRNA的灵敏、快速、简便检测。

Preparation of ruthenium tripyridine electrochemiluminescence quenching biosensor

The preparation method of tripyridine ruthenium electrochemiluminescence quenching biosensor belongs to the field of biosensor preparation. The steps include: 1) identifying the microRNAs to be detected and designing hairpin probes according to the principle of sequence complementarity; 2) electrodeposition of graphene oxide on the surface of glassy carbon electrode; 3) competitive adsorption of 1_pyrene butyric acid_N_hydroxysuccinimide ester (PASE) and methylene blue (MB) on the surface of electroreduced graphene oxide; 4) competitive adsorption of 3_azido_1_n-propylamine (3). Azido_1_PrA) reacts with PASE to azide the electrode surface; 5) synthesizes Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS-labeled electrochemiluminescent probe Ru_DNA; 6) Ru_DNA reacts with click chemistry to assemble the electrode surface. 7) When the target microRNAs exist, the resonance energy transfer between the luminescent substance Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS and quenching agent MB is blocked and the electrochemiluminescent signal intensity is changed. The invention can realize sensitive, fast and simple detection of target miRNA.

【技术实现步骤摘要】
三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法
本专利技术涉及一种基于亚甲基蓝淬灭三联吡啶钌体系电化学发光信号，构建用于检测miRNA生物传感器的新方法，属于生物传感器制备领域。该方法可应用于miRNA临床诊断以及对miRNA的定量分析。
技术介绍
成熟的microRNAs(miRNAs)是一类保守进化的、非编码的、长度为19-23个碱基的单链RNAs，作为动植物体内的后转录调控者，调节其目标基因的表达。近些年，有越来越多的证据显示miRNAs在各种生物过程中都发挥着重要的作用，例如生物的早期发育，细胞分化，增殖，细胞凋亡和造血作用。最近有研究表明，miRNAs的异常表达与人类疾病的产生与发展、遗传异常以及免疫系统功能的改变有着密切的联系。例如，在乳腺癌患者的血清中检测到可致癌miRNA：miR-155的存在，于乳腺癌细胞内下调细胞信号因子1(SOCS1)的抑制作用。随后发现当其与miR-145和miR-182联合作用时，对于乳腺癌的检测更为灵敏精确。此外据报道，由miR-486、miR-30d、miR-1以及miR-499共同构成的miRNA集合与接受手术治疗和辅助化疗的肺癌患者的整体生存率有关。结合目前的研究，科研人员开始探究miRNA是否可以作为一种新生物标志物用于肿瘤的早期诊断。由于miRNA剖面法在初期和临床医学分析所起到的重要作用，各种各样的检测方法被建立并用于对miRNA的精确检测。例如，逆转录实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，RNA印迹法，微阵列法，表面等离子体共振技术以及荧光光谱法。然而，这些方法往往具有成本高，灵敏度低，耗时等缺点，因此在应用方面受到了一定的限制。如今，医学诊断测试逐渐趋向于简单化，构建一个程序简单、快速的检测方法准确分析miRNA是十分必要的，因此大量的生物传感器应运而生。因其具有低成本，小尺寸和操作简单等独特的优势，这一技术被广泛认为是检测miRNA最有前途的方法。电化学发光技术指的是物质在电极表面发生电荷转移反应产生激发态物质，最终回到基态的光发射过程。因其兼具化学发光方法灵敏度高的优点以及电化学检测方法卓越的可控性，应用电化学发光技术于miRNA的传感检测倍受关注。电化学发光物质种类繁多，例如三联吡啶钌、鲁米诺、光泽精、吖啶酯、氧化草酸酯、量子点以及金属纳米簇等等。其中，三联吡啶钌电化学发光因具有高灵敏度和宽动态检测范围的优点被广泛应用于医学和免疫分析领域。总体来说，三联吡啶钌电化学发光信号可分为两种类型，即电化学发光信号增强和电化学发光信号淬灭。先前大量的工作集中在前者并取得了很好的检测效果。近些年，越来越多的科研人员对三联吡啶钌的电化学发光淬灭作用进行深入研究，总结并提出了六种淬灭机制：(1)能量转移导致的淬灭作用，(2)电化学氧化导致的淬灭作用，(3)共反应剂自由基引起的淬灭作用，(4)电荷转移导致的淬灭作用，(5)超分子引起的淬灭作用，(6)共振能量转移导致的淬灭作用。在取得以上有关电化学发光淬灭作用研究进展的基础上，目前热点在于寻求新的电化学发光淬灭物质并发现其淬灭机理，以便扩大电化学发光信号淬灭技术在分析领域中的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于亚甲基蓝淬灭三联吡啶钌体系电化学发光信号，构建用于检测miRNA生物传感器的新方法。此方法基于亚甲基蓝与三联吡啶钌之间满足电化学发光共振能量转移的发生条件，通过发卡发光探针Ru-DNA构型的转换引起电化学发光信号的改变，从而更灵敏地检测目标miRNA。该方法操作简便、无需封闭、特异性强、重现性高。本专利技术采取如下技术方案：三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法，包括以下步骤：1)确定待检测的目标miRNA，设计与其碱基互补的DNA发卡探针序列。2)玻碳电极的预处理：打磨玻碳电极，超声清洗，氮气吹干后将电极浸入1mg/mL氧化石墨烯溶液中，通过循环伏安法，初始电压和高电位设置为0.5V，低电位为-1.5V，在此区间内循环扫描电沉积氧化石墨烯，电沉积圈数为10圈，全程在氮气氛围中。3)用移液枪吸取10μLPASE与MB的混合液(PASE和MB的总摩尔浓度为5mM且摩尔浓度比为1:3)滴加在电极上，室温下放置1h，二者通过π-π堆积作用吸附在电还原氧化石墨烯表面。4)滴加10μL3-Azido-1-PrA溶液在电极表面，此反应在室温下进行。5)电化学发光发卡探针Ru-DNA的合成：将50μL50μMDNA发卡探针溶液加入200μL1mMRu(bpy)2(dcbpy)NHS的DMF溶液中，此反应于恒温混匀仪中室温下振荡过夜。然后向混合液中加入100μL3mol/L无水醋酸钠溶液以及1.5mL冷无水乙醇，将溶液在-20℃下冷却24h。将混合物在12000转/分钟转速下离心30min，小心去除上层黄色溶液，沉淀物用无水乙醇清洗三次，除去未反应的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。最后将得到的黄色沉淀溶于50μL5mMPBS缓冲液(pH＝7.4)中，于-20℃储存。6)在电极表面滴加10μL含有电化学发光发卡探针的点击化学溶液，于室温下反应过夜。此过程中发光探针的5’端炔烃基团部分与电极表面的叠氮基团在五水硫酸铜、抗坏血酸钠和三[(1-苄基-1H-1,2,3-3唑-4-基)甲基]胺(TBTA)的催化作用下发生点击化学反应，将发光探针Ru-DNA组装到电极表面。7)将目标miRNA溶液滴加到组装好的电极表面，于室温下孵育30min，Ru-DNA发卡结构打开并转换成刚性的DNA-miRNA双链结构。优选的是，设计的DNA发卡探针实验时先用PCR仪升温至95℃并保持5min，之后降至室温，使其形成茎-环结构，其中茎部碱基凭借氢键作用互补配对，环部碱基为单链结构且序列与目标miRNA互补，此发卡结构对于目标miRNA具有特异性识别作用。优选的是，设计的DNA发卡探针3’端修饰氨基基团，5’端修饰炔烃基基团。优选的是，电沉积氧化石墨烯过程中的扫速为100mV/s，扫描圈数为10圈，全过程在氮气氛围中进行。优选的是，PASE与MB二者的混合溶液由PASE的二甲基甲酰胺(DMF)溶液与MB的DMF溶液按浓度比为1:3混合，震荡摇匀获得。并且此混合液在每次使用前需现用现配。优选的是，滴加的3-Azido-1-PrA浓度为2mM，室温下反应时间为120min。优选的是，合成Ru-DNA所需的DNA发卡探针溶液由5mMPBS缓冲液(pH＝7.4)配置，浓度为50μM，体积为50μL。参与反应的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS溶液浓度为1mM。优选的是，冷却Ru-DNA时加入的无水醋酸钠溶液浓度为3mol/L，体积为100μL，无水乙醇体积为1.5mL。优选的是，点击化学溶液中含有：五水硫酸铜，其浓度为1μM；抗坏血酸钠，其浓度为2μM；三[(1-苄基-1H-1,2,3-3唑-4-基)甲基]胺(TBTA)，其浓度为1.1μM以及Ru-DNA电化学发光发卡探针，其浓度为20μM。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和良好效果：1)亚甲基蓝与三联吡啶钌之间构成新颖的电化学发光共振能量转移体系，二者在近距离接触时可引起三联吡啶钌电化学发光信号的淬灭，基于此原理构建一种电化学发光传感器用于miRNA的检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)确定待检测的目标miRNA，设计与其碱基互补的DNA发卡探针序列；2)玻碳电极的预处理：打磨玻碳电极，超声清洗，氮气吹干后将电极浸入1mg/mL氧化石墨烯溶液中，通过循环伏安法，初始电压和高电位设置为0.5V，低电位为‑1.5V，在此区间内循环扫描电沉积氧化石墨烯，扫描圈数为10圈，电沉积全程在氮气氛围中；3)用移液枪吸取10μL 1‑芘丁酸‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯PASE与亚甲基蓝MB的混合液，滴加在电极上，室温下放置1h，二者通过π‑π堆积作用吸附在电还原氧化石墨烯表面；其中PASE和MB的总摩尔浓度为5mM且摩尔浓度比为1:3；4)滴加10μL 3‑叠氮基‑1‑正丙胺3‑Azido‑1‑PrA溶液在电极表面，室温下反应；5)电化学发光发卡探针Ru‑DNA的合成：将50μL 50μM DNA发卡探针溶液加入200μL 1mM Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的DMF溶液中，此反应于恒温混匀仪中室温下振荡过夜；然后向混合液中加入100μL 3mol/L无水醋酸钠溶液以及1.5mL无水乙醇，将溶液在‑20℃下冷却24h；将冷却后的溶液在12000转/分钟转速下离心30min，小心去除上层黄色溶液，沉淀物用无水乙醇清洗三次，除去未反应的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS；最后将得到的黄色沉淀溶于50μL 5mM PBS缓冲液中，于‑20℃储存；6)在电极表面滴加10μL含有电化学发光发卡探针的点击化学溶液，于室温下反应过夜；此过程中发光探针的5’端炔烃基团部分与电极表面的叠氮基团在五水硫酸铜、抗坏血酸钠和三[(1‑苄基‑1H‑1,2,3‑3唑‑4‑基)甲基]胺(TBTA)的催化作用下发生点击化学反应，将发光探针Ru‑DNA组装到电极表面；点击化学溶液中含有1μM五水硫酸铜、2μM抗坏血酸钠、1.1μM三[(1‑苄基‑1H‑1,2,3‑3唑‑4‑基)甲基]胺以及20μM Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记的DNA发卡探针；7)将目标miRNA溶液滴加到组装好的电极表面，于室温下孵育30min，Ru‑DNA发卡结构打开并转换成刚性的DNA‑miRNA双链结构。...

【技术特征摘要】
1.三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)确定待检测的目标miRNA，设计与其碱基互补的DNA发卡探针序列；2)玻碳电极的预处理：打磨玻碳电极，超声清洗，氮气吹干后将电极浸入1mg/mL氧化石墨烯溶液中，通过循环伏安法，初始电压和高电位设置为0.5V，低电位为-1.5V，在此区间内循环扫描电沉积氧化石墨烯，扫描圈数为10圈，电沉积全程在氮气氛围中；3)用移液枪吸取10μL1-芘丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯PASE与亚甲基蓝MB的混合液，滴加在电极上，室温下放置1h，二者通过π-π堆积作用吸附在电还原氧化石墨烯表面；其中PASE和MB的总摩尔浓度为5mM且摩尔浓度比为1:3；4)滴加10μL3-叠氮基-1-正丙胺3-Azido-1-PrA溶液在电极表面，室温下反应；5)电化学发光发卡探针Ru-DNA的合成：将50μL50μMDNA发卡探针溶液加入200μL1mMRu(bpy)2(dcbpy)NHS的DMF溶液中，此反应于恒温混匀仪中室温下振荡过夜；然后向混合液中加入100μL3mol/L无水醋酸钠溶液以及1.5mL无水乙醇，将溶液在-20℃下冷却24h；将冷却后的溶液在12000转/分钟转速下离心30min，小心去除上层黄色溶液，沉淀物用无水乙醇清洗三次，除去未反应的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS；最后将得到的黄色沉淀溶于50μL5mMPBS缓冲液中，于-20℃储存；6)在电极表面滴加10μL含有电化学发光发卡探针的点击化学溶液，于室温下反应过夜；此过程中发光探针的5’端炔烃基团部分与电极表面的叠氮基团在五水硫酸铜、抗坏血酸钠和三[(1-苄基-1H-1,2,3-3唑-4-基)甲基]胺(TBTA)的催化作用下发生点击化学反应，将发光探针Ru-DNA组装到电极表面；点击化...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁理平，刘畅，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11