一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体及其应用和制法、核酸、表达载体及宿主细胞制造技术

本发明专利技术采用易错PCR、shuffling的方法筛选出一种S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体，在野生型SAHH序列SEQ ID NO.1的基础上包含选自N27A、M38H、L45I、E65D、T84S、Y110F、N126D、P176A、K204D、T276S、V316A、A368V任意两个以上氨基酸位点的突变。该突变体的活性提高了一倍，稳定性也有所提高，而且耐热性也比较好。本发明专利技术还公开了编码该S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体的核酸，包括所述核酸的表达载体、包括所述表达载体的宿主细胞。

A S-adenosylhomocysteine hydrolase mutant and its application and preparation, nucleic acid, expression vector and host cell

A mutant of S_adenosine homocysteine hydrolase was screened by error-prone PCR and shuffling method. The mutant contained mutations at any two or more amino acid sites selected from N27A, M38H, L45I, E65D, T84S, Y110F, N126D, P176A, K204D, T276S, V316A, A368V on the basis of wild-type SAHH sequence SEQ ID NO.1. . The activity of the mutant is doubled, the stability is improved, and the heat resistance is good. The invention also discloses nucleic acids encoding the S_adenosine homocysteine hydrolase mutant, including the expression vector of the nucleic acid and the host cell including the expression vector.

【技术实现步骤摘要】
一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体及其应用和制法、核酸、表达载体及宿主细胞
本专利技术涉及一种酶及其应用和制法，编码该酶的核酸，包括所述核酸的表达载体，包括所述表达载体的宿主细胞，它涉及一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体及其应用和制法，编码该S-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体的核酸，包括所述核酸的表达载体，包括所述表达载体的宿主细胞。
技术介绍
同型半胱氨酸（Hcy）为含巯基氨基酸，是体内甲硫氨酸循环过程中的一个代谢中间产物。血液中总Hcy浓度的病理性升高会导致高同型半胱氨酸血症。近年来的研究已确认，高同型半胱氨酸血症与作为人类第一杀手的动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等多种心血管疾病的发生有密切关系，是心血管疾病的一个新的独立和重要的危险因素。目前国内外已经把Hcy作为心血管疾病的一个检测指标。Hcy检测方法中最快捷、灵敏度高、适合大批量样品检测，并且可以上生化分析仪自动分析的是Hcy检测试剂盒。其中最常用的是循环酶法试剂盒，试剂盒中最核心的酶是Hcy甲基转移酶（HMT）和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。游离型Hcy与共价底物S-腺苷甲硫氨酸（S-AdenosylMethionine，SAM）在同型半胱氨酸甲基转移酶（HomocysteineMethyltransferase，HMT）的催化下反应，形成甲硫氨酸（Met）和S-腺苷同型半胱氨酸（S-AdenosylHomocysteine，SAH），SAH被S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)水解成腺苷(Ado)和Hcy，形成的Hcy可以循环加入反应，从而放大检测信号。这些反应被用来研发同型半胱氨酸检测试剂盒。国内外已有SAHH表达的文章和专利。徐明旭等人（高特异性活性重组S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)的制备与高度表达及对S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的改进分析，专利申请号：CN01803726.7）在大肠杆菌中表达了滴虫来源的SAHH基因。金晓霞等人（黄瓜S-腺苷L-高半胱氨酸水解酶全长cDNA的克隆及表达分析）克隆了黄瓜SAHHcDNA基因。王倩等人（大肠杆菌密度感应缺陷株中SAHH基因克隆与表达的研究）在大肠杆菌密度感应缺陷株中表达了GST-SAHH融合蛋白，产物大小为75kD。表达产物恢复了该缺陷菌株的甲基循环，表明产物具有SAHH活性。王源（青岛文昌鱼SAHH基因的鉴定表达及进化分析，山东理工大学2008年硕士论文）在大肠杆菌中表达了青岛文昌鱼SAHH，产物具备酶活性。宁波美康邹炳德等人（基因工程菌，用其制备重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及该酶的应用，专利申请号：CN201210027921.8）通过PCR技术从环境中筛选得到一个SAHH基因片段，该基因编码416个氨基酸，和嗜酸热硫化叶菌SAHH有98%同源性，但有13个氨基酸的差异。表达产物能催化腺苷同型半胱氨酸水解为腺苷和同型半胱氨酸，并且该SAHH对腺苷同型半胱氨酸的Km值为0.009+0.0009mM。但是耐热性不够好。余凯茜（采用小分子捕获技术的同型半胱氨酸检测方法，申请号：CN03145972.2）采用突变过的SAHH作为试剂盒成分参与同型半胱氨酸检测，突变的SAHH对NAD和同型半胱氨酸的亲和力有所提高，但催化活性降低10%-50%。袁崇生（同型半胱氨酸检测方法，专利号：US7192729B2）采用突变的SAHH作为试剂盒成分参与同型半胱氨酸检测，突变的SAHH提高了对同型半胱氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸或腺苷的亲和力，但减弱了催化活性。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的一在于提供一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体，活性、稳定性提高的SAHH突变体，而且耐热性也比较好。本专利技术的上述技术目的一是通过以下技术方案得以实现的：一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体，所述的突变体为在野生型SAHH序列SEQIDNO.1的基础上包含选自N27A、M38H、L45I、E65D、T84S、Y110F、N126D、P176A、K204D、T276S、V316A、A368V任意两个以上氨基酸位点的突变。通过采用上述技术方案，通过理论知识和经验，选取了在特定氨基酸位置上进行定向突变，与野生型（WT）相比，突变体的活性和稳定性都有一定的提高，而且耐热性也得到了提高。本专利技术的目的二在于提供一种编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸，编码获得的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体相对于野生型SAHH的活性和稳定性都得到了显著提高。本专利技术的上述技术目的二是通过以下技术方案得以实现的：一种编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸，所述核酸为编码上述方案中所述的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸。通过采用上述技术方案，本专利技术选取了密码子经过优化的基因序列，且经过基因测序。经过优化后的基因与宿主的密码子使用频率相匹配可用来提高蛋白表达水平。本专利技术的目的三在于提供一种表达载体，表达载体中含有的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体相对于野生型SAHH的活性和稳定性都得到了显著提高。本专利技术的上述技术目的三是通过以下技术方案得以实现的：一种表达载体，包含上述方案中所述的核酸。本专利技术进一步设置为：所述表达载体为pET系列的载体，带有T7启动子。通过采用上述技术方案，优选的pET系列的载体，带有T7启动子，T7表达系统可使用强力的噬菌体T7启动子进行高水平表达。它非常适用于在大肠杆菌中表达可溶的无毒性重组蛋白质。本专利技术得到的pET-28a-SAHH在进行表达时得到了明显的高水平表达，平均每g离心后的菌体中蛋白的产量经过纯化可得到至少约40mg的纯度高达至少95%以上的目的蛋白。本专利技术的目的四在于提供一种宿主细胞，宿主细胞中含有的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体相对于野生型HMT的活性和稳定性都得到了显著提高。本专利技术的上述技术目的四是通过以下技术方案得以实现的：一种宿主细胞，包含上述方案中所述的表达载体。本专利技术进一步设置为：所述宿主细胞为原核细胞。本专利技术进一步设置为：所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。本专利技术进一步设置为：所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）细胞。通过采用上述技术方案，本专利技术优选BL21（DE3）细胞，其特点是T7RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，非常适用于T7、T7Lac启动子的表达系统，如pET、pEASY等。上述本专利技术优选了pET-28a系列的表达载体，配对BL21（DE3）表达细胞，是非常利于SAHH蛋白的可溶性高表达量的表达。本专利技术的目的五在于提供S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的应用，催化S-腺苷同型半胱氨酸水解生成腺苷和同型半胱氨酸效率更高。本专利技术的上述技术目的五是通过以下技术方案得以实现的：上述方案中S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体催化S-腺苷同型半胱氨酸水解生成腺苷和同型半胱氨酸的应用。本专利技术的目的六在于提供S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的制备方法，制备方法简单高效。本专利技术的上述技术目的六是通过以下技术方案得以实现的：上述方案中所述的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的制备方法，步骤如下：S1首先将编码SAHH的核酸序列按照大肠杆菌密码子偏好进行优化并合成；S2采用易错PCR方法、DNA改组（shuffling）本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体，其特征在于，所述的突变体为在野生型SAHH序列SEQ ID NO.1的基础上包含选自N27A、M38H、L45I、E65D、T84S、Y110F、N126D、P176A、K204D、T276S、V316A、A368V任意两个以上氨基酸位点的突变。

【技术特征摘要】
1.一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体，其特征在于，所述的突变体为在野生型SAHH序列SEQIDNO.1的基础上包含选自N27A、M38H、L45I、E65D、T84S、Y110F、N126D、P176A、K204D、T276S、V316A、A368V任意两个以上氨基酸位点的突变。2.一种编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸，其特征在于，所述核酸为编码权利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸。3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列的载体，带有T7启动子。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求3或4所述的表达载体。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。8...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓霞，彭毅，
申请(专利权)人：苏州汇桢生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32