通过用内切H共表达的体内N-去糖基化重组蛋白质的生产制造技术

植物已经成为一种替代的表达系统，并且越来越多地被工业和学术界用于生产靶蛋白。然而，植物使蛋白质糖基化的能力对于那些不需要N‑糖基化的蛋白质可能是显著的限制。例如，恶性疟原虫蛋白或人类因子XIII的A链不携带N‑连接的聚糖，或炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)不是糖蛋白；然而，这些蛋白质含有潜在的N‑连接的糖基化位点，其可能在酵母菌、哺乳动物或植物系统中的表达期间异常地被糖基化，由于表位的不正确/变异的折叠和/或掩蔽，可能导致降低的功能性和免疫原性。为了克服这个问题，我们最近通过使用植物中的瞬时表达与细菌PNGase F(肽：N‑糖苷酶F)共表达开发了体内蛋白质的酶促去糖基化的策略(WIPO专利申请WO/2012/170678)，这允许生产可提供高传播阻断(TB)活性的疟疾疫苗候选物Pfs48/45(Mamedov等人，2012)。此外，与糖基化的形式相比，其他去糖基化的抗原在小鼠中诱导了显著更高水平的毒素‑中和抗体应答(Mamedov等人，原稿已提交)。尽管PNGase F处理(体内去糖基化)完整地除去寡糖，但由于NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成天冬氨酸(D)，导致去糖基化的蛋白中的氨基酸改变。在这项研究中，开发了一种策略，用于在植物中生产以非N‑糖基化形式的靶蛋白，但是所得到的去糖基化的蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变，这可以提高具有天然样折叠的植物或其他真核系统中的非N‑糖基化重组蛋白质的生产。因此，本发明专利技术描述了使用瞬时表达系统、通过在植物中与内切‑β‑N‑乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H)共表达，用于重组N‑糖基化蛋白质的体内去糖基化的材料和方法。还提供了在植物中表达活性内切H的方法。

Production of recombinant glycosylated protein by N- in vivo co expressed with endonuclease H

Plants have become an alternative expression system and are increasingly being used in industry and academia to produce target proteins. However, the ability of plants to glycosylate proteins may be a significant limitation for proteins that do not require N_glycosylation. For example, Plasmodium falciparum proteins or human factor XIII A chains do not carry N_linked glycans, or Bacillus anthracis protective antigens (PAs) are not glycoproteins; however, these proteins contain potential N_linked glycosylation sites that may be abnormally expressed in yeast, mammalian, or plant systems during expression. Glycosylation, due to incorrect epitope/variant folding and/or masking, may result in reduced functionality and immunogenicity. To overcome this problem, we recently developed an enzymatic de-glycosylation strategy for proteins in vivo (WIPO patent application WO/2012/170678) by using transient expression in plants and co-expression with bacterial PNGase F (peptide: N_glycosidase F), which allows the production of Pfs48/45 (Mame) vaccine candidates with high TB activity. Dov et al., 2012). In addition, other glycosylated antigens induced significantly higher levels of toxin neutralizing antibody responses in mice than in glycosylated forms (Mamedov et al., manuscript submitted). Although PNGase F treatment (in vivo deglycosylation) completely removed the oligosaccharides, asparagine (N) in the NxS / T site (sequence) was deamidated to aspartic acid (D), resulting in amino acid changes in the deglycosylated proteins. In this study, a strategy was developed for the production of non-N_glycosylated target proteins in plants, but the N xS/T site of the resulting deglycosylated proteins remained unchanged, which could improve the production of non-N_glycosylated recombinant proteins in plants with natural folds or other eukaryotic systems. Production. Therefore, the present invention describes materials and methods for in vivo deglycosylation of recombinant N_glycosylated proteins by co-expression with endo_beta_N_acetylglucosaminidase H (endo H) in plants using a transient expression system. The method of expressing active endonuclease H in plants is also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过用内切H共表达的体内N-去糖基化重组蛋白质的生产
该文本涉及用于在植物中生产以非N-糖基化形式的感兴趣的重组蛋白的材料和方法。开发了用于在植物中生产以非N-糖基化形式的靶蛋白的策略，但是在得到的去糖基化蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变，这可以提供具有天然样折叠的植物或其他真核表达系统中的非N-糖基化重组蛋白的生产。描述了使用瞬时表达系统、通过与植物中的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H)共表达，用于重组N-糖基化蛋白质的体内去糖基化的材料和方法。还提供了表达植物中的活性内切H的方法。
技术实现思路
植物已经成为一种替代的表达系统，并且越来越多地被工业和学术界用于生产靶蛋白。然而，植物使蛋白质糖基化的能力对于那些不需要N-糖基化的蛋白质可能是显著的限制。例如，恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)蛋白或人类因子XIII的A链不携带N-连接的聚糖，或炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的保护性抗原(PA)不是糖蛋白；然而，这些蛋白质含有潜在的N-连接的糖基化位点，其可能在酵母菌、哺乳动物或植物系统中的表达期间异常地被糖基化，由于表位的不正确/变异的折叠和/或掩蔽，这可能导致降低的功能性和免疫原性。为了克服这个问题，我们最近通过使用植物中的瞬时表达与细菌PNGaseF(肽：N-糖苷酶F)共表达开发了体内蛋白质的酶促去糖基化的策略(WIPO专利申请WO/2012/170678)，这允许生产可提供高传播阻断(TB)活性的疟疾疫苗候选物Pfs48/45(Mamedov等人，2012)。此外，与糖基化的形式相比，其他去糖基化的抗原在小鼠中诱导了显著更高水平的毒素-中和抗体应答(Mamedov等人，原稿已提交)。尽管PNGaseF处理(体内去糖基化)完整地除去寡糖，但由于NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成为天冬氨酸(D)，导致去糖基化的蛋白质中的氨基酸改变。在这项研究中，开发了一种策略，用于在植物中生产以非N-糖基化形式的靶蛋白，但是在得到的去糖基化蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变，这可以提供具有天然样折叠的植物或其他真核系统中的非N-糖基化重组蛋白质的生产。因此，本专利技术描述了使用瞬时表达系统、通过在植物中与内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H)共表达，用于重组N-糖基化蛋白质的体内去糖基化的材料和方法。还提供了在植物中表达活性内切H的方法。
技术介绍
N-糖基化对于许多蛋白质的正确折叠和稳定性是关键的PTM，并且在异源表达系统中产生的许多重组蛋白质的生物学活性取决于它们的糖基化状态。然而，一些真核的以及细菌的蛋白质在天然宿主中不含N-聚糖，但含有多个潜在的N-糖基化位点，当这些蛋白质在异源真核表达系统中被表达时，这些N-糖基化位点可能异常地被糖基化，由于表位的不正确/变异的折叠或掩蔽可能导致降低的功能性和免疫原性。例如，恶性疟原虫的Pfs48/45蛋白质或人类因子XIII的A链不携带N-连接的聚糖，并且炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)不是糖蛋白；然而，这些蛋白质含有可能在酵母菌、哺乳动物或植物系统的表达过程中被异常糖基化的潜在的N-连接的糖基化位点。植物已经成为一种替代的表达系统，并且越来越多地被工业和学术界用于生产靶蛋白。然而，植物使蛋白质糖基化的能力也可能是对基于植物的表达系统的有用性的显著限制。在我们先前的研究中，我们已经使用植物中的瞬时表达、通过与细菌PNGaseF(肽：N-糖苷酶F)共表达开发了体内蛋白质的酶促去糖基化的策略(WIPO专利申请WO/2012/170678)。使用体内去糖基化策略，在本萨明那烟草(N.benthamiana)中生产了以非N-糖基化形式的Pfs48/45蛋白质，并且针对Pfs48/45蛋白质的不同表位生产的四种mAbs(其中两种是构象特异性的)识别的Pfs48/452-至6-折叠的去糖基化形式要好于它们识别的相同蛋白质的糖基化形式(Mamedov等人，2012)。另外，仅利用体内PNGaseF-去糖基化的Pfs48/45观察到了最强的结合和最大的mAbIII信号抑制，而Pfs48/45的体外去糖基化、糖基化(Mamedov等人，2011)与它们抑制mAbIII信号的能力相等。此外，这也与其他靶标一起进行了测试，结果显示只有体内去糖基化形式与抗体具有更强的结合，与体外去糖基化和糖基化形式相比，表明异常糖基化可能导致重要表位的掩蔽或引起Pfs48/45蛋白质的不正确/变异的折叠(Mamedov等人，2012)。内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H，EC3.2.1.96)是由链霉菌(Streptomycesplicatus)和少数其他链霉菌属(Streptomyces)物种分泌的糖水解酶()(Tarentino等人，1976)。它切割寡糖的N-乙酰基葡糖胺核心的β-1,4-糖苷键并且使一个N-乙酰基壳二糖(N-acetylchitobiose)与糖蛋白的天冬酰胺残基连接(Trimble等人，1978；Muramatsu1971)。链霉菌的内切H基因为939bp(GenBank登记号AAA26738.1)，编码28.9-kDa蛋白质。来自链霉菌的内切H最近在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中被表达，并且通过共发酵和发酵后处理，体外证实了巴斯德毕赤酵母产生的内切H的去糖基化活性(Wang等人，2015)。然而，蛋白质在体内条件下通过内切H酶的N-去糖基化尚未实现。在本研究中，描述并呈现了使用瞬时表达系统、通过与植物中的内切H共表达，对重组N-糖基化蛋白质进行体内去糖基化。专利技术目的在我们以前的研究中，通过与细菌PNGaseF共表达靶蛋白，我们已经论证了在体内靶蛋白的去糖基化(MamedovT.WO/2012/170678，2012；Mamedov等人，2012)。虽然通过PNGaseF的去糖基化(体内或体外)完全除去寡糖，但由于NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成为天冬氨酸(D)，导致去糖基化的蛋白质中的氨基酸改变。此时，其他去糖基化酶(如内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H))——其催化N-连接的聚糖的壳二糖核心的两个GlcNAc残基之间的切割，从而将单个GlcNAc残基连接到天冬酰胺(图1)，并且与PNGaseF相反，通过内切H的去糖基化导致所得去糖基化蛋白质的NxS/T位点的氨基酸序列没有变化。由于内切H处理在所得的去糖基化蛋白质中不产生氨基酸变化，因此我推测通过内切H产生的去糖基化蛋白质可能具有更多天然样折叠，因此与相同蛋白质的PNGaseF去糖基化形式相比，具有更好的功能活性(免疫原性、受体结合、蛋白质-抗体相互作用、酶活性等)。我还推测，由于内切H切割使一个GlcNAc残基与天冬酰胺连接，剩余的单糖产生电荷，从而可以提高去糖基化蛋白质的溶解度和稳定性。本专利技术的工业应用如上所述，PNGaseF处理(体内去糖基化)完整除去寡糖，但由于NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺()脱酰胺成为天冬氨酸，导致去糖基化蛋白质中的氨基酸改变。内切H处理导致在所得去糖基化蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变。在此，推测由内切H产生的去糖基化蛋白质可具有更多天然样折叠，因此与相同蛋白质的经PNG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生N‑去糖基化的感兴趣的多肽的方法，该方法通过使用：(a)包含编码细菌内切H(内切‑β‑N‑乙酰氨基葡糖苷酶H，内切H，EC3.2.1.96)的第一核苷酸序列的第一核酸，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至启动子，使得当所述启动子被激活时，内切H多肽被表达；和(b)包含编码所述感兴趣的多肽的核苷酸序列的第二核酸，其中所述第二核苷酸序列可操作地连接至启动子，使得当所述启动子被激活时，所述感兴趣的多肽被表达，(c)以及其中通过所述内切H多肽的作用，所述感兴趣的多肽被去糖基化，在所得多肽的NxS/T位点(序列)中没有氨基酸改变，与PNGase F的作用相反，由于在NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成为天冬氨酸(D)，PNGase F导致在去糖基化的蛋白质靶中的氨基酸改变，(d)包含编码细菌内切H(内切‑β‑N‑乙酰氨基葡糖苷酶H，内切H，EC3.2.1.96)多肽的第一核苷酸序列的第一核酸，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至启动子，使得当启动子被激活时，所述内切H多肽被表达，以及包含编码感兴趣的靶多肽的核苷酸序列的第二核酸，(e)通过所述内切H多肽的作用，所述感兴趣的多肽被去糖基化，在NxS/T位点(序列)中没有氨基酸改变，和(f)通过所述内切H多肽的作用，所述感兴趣的多肽被去糖基化，并且内切H多肽切割，使得一个GlcNAc残基与天冬酰胺连接，剩余的单糖赋予电荷，由此提高了去糖基化的多肽的溶解度和稳定性，和(g)生产非糖基化的疫苗抗原、治疗性蛋白质、抗体和细菌蛋白质(尤其是疫苗抗原候选物)酶。此外，本专利技术可以用于在任何真核体系中生产工业酶，尤其是细菌源酶，用于提高生物质能/生物燃料的产量，以及改善食品质量，特别是用于生产天然添加剂。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于产生N-去糖基化的感兴趣的多肽的方法，该方法通过使用：(a)包含编码细菌内切H(内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H，内切H，EC3.2.1.96)的第一核苷酸序列的第一核酸，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至启动子，使得当所述启动子被激活时，内切H多肽被表达；和(b)包含编码所述感兴趣的多肽的核苷酸序列的第二核酸，其中所述第二核苷酸序列可操作地连接至启动子，使得当所述启动子被激活时，所述感兴趣的多肽被表达，(c)以及其中通过所述内切H多肽的作用，所述感兴趣的多肽被去糖基化，在所得多肽的NxS/T位点(序列)中没有氨基酸改变，与PNGaseF的作用相反，由于在NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成为天冬氨酸(D)，PNGaseF导致在去糖基化的蛋白质靶中的氨基酸改变，(d)包含编码细菌内切H(内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H，内切H，EC3.2.1.96)多肽的第一核苷酸序列的第一核酸，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至启动子，使得当启动子被激活时，所述内切H多肽被表达，以及包含编码感兴趣的靶多肽的核苷酸序列的第二核酸，(e)通过所述内切H多肽的作用，所述感兴趣的多肽被去糖基化，在NxS/T位点(序列)中没有氨基酸改变，和(f)通过所述内切H多肽的作用，所述感兴趣的多肽被去糖基化，并且内切H多肽切割，使得一个GlcNAc残基与天冬酰胺连接，剩余的单糖赋予电荷，由此提高了去糖基化的多肽的溶解度和稳定性，和(g)生产非糖基化的疫苗抗原、治疗性蛋白质、抗体和细菌蛋白质(尤其是疫苗抗原候选物)酶。此外，本发明可以用于在任何真核体系中生产工业酶，尤其是细菌源酶，用于提高生物质能/生物燃料的产量，以及改善食品质量，特别是用于生产天然添加剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞是植物细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是本萨明那烟草细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与SEQIDNO：1中列出的序列具有至少90％的序列同一性。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述内切H多肽具有与SEQIDNO：2中列出的序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸和第二核酸经由农杆菌构建物被引入所述细胞中。7.一种用于产生N-去糖基化的感兴趣的多肽的方法，该方法通过使用：(a)包含编码感兴趣的细菌内切H(内切-β-N-乙酰氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·马梅德夫，
申请(专利权)人：T·马梅德夫，
类型：发明
国别省市：土耳其,TR