本申请公开了FAD2性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白。具体公开了在FAD2基因座中进行基因破坏、基因编辑或基因堆叠的方法和组合物，其是通过以定点的方式剪切大豆细胞FAD2基因中的一个位置，从而在FAD2基因中产生断裂(break)，然后任选地该断裂中整合入感兴趣的核酸分子。
FAD2 functional loci and corresponding target site specific binding proteins that can induce targeted breakage
The present application discloses a FAD2 performance locus and a corresponding target site specific binding protein capable of inducing targeted breakage. Specifically disclosed are methods and compositions for gene destruction, gene editing, or gene stacking at FAD2 loci, which produce breaks in the FAD2 gene by site-directed cleavage of a location in the FAD2 gene of soybean cells, and then optionally integrate interesting nucleic acid molecules into the break.
【技术实现步骤摘要】
FAD2性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白本申请是2013年9月5日提交的申请号为201380058037.3(PCT申请号为PCT/US2013/058299)、专利技术名称为“FAD2性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请交叉引用本申请要求获得于2012年9月7日提交的美国临时专利申请No.61/697,886的优先权，本文通过提述并入其全部内容。公开领域本公开一般地涉及用于植物重组技术(例如，用于产生转基因植物)的组合物和方法。更具体地，本公开涉及植物细胞和植物，它们的基因组中包含可用于位点特异性地引入任何感兴趣核酸的基因座。背景许多植物被外源核酸(例如转基因)遗传转化以引入期望的性状，例如提高农业价值。可以通过遗传转化提高农业价值的实例包括：提高营养品质，提高产量，害虫或疾病抗性，干旱和胁迫耐受性，提高园艺品质(例如，改善色素沉着和/或生长)，除草剂抗性，从植物产生工业上有用的化合物和/或材料，和/或生产药物。将克隆的基因引入到植物细胞中并回收稳定可育的转基因植物，可用于制造在多个世代中稳定的植物遗传修饰，借此实现对作物的遗传工程化。在用于遗传转化和产生转基因植物的方法中，通常将外源DNA随机引入到真核植物细胞的细胞核或质体DNA中，随后分离含有被整合的外源DNA的细胞，然后再生被稳定转化的植物。转基因植物通常通过土壤杆菌介导的转化技术产生。这些技术的成功刺激了其他用于将感兴趣核酸分子引入到植物基因组内的方法的发展，例如PEG介导的原生质体DNA摄取，基因枪(微粒轰击)，和晶须硅介导的转化。然而，在所有这些植物转化方法中，引入到植物基因组中的外源核酸被随机整合到植物细胞的基因组中，并且拷贝数可不预测。Teradaetal.(2002)NatBiotechnol20(10):1030；Teradaetal.(2007)PlantPhysiol144(2):846；D'Halluinetal.(2008)PlantBiotechnologyJ.6(1):93。例如，转基因经常以重复序列的形式被整合，或者是整个转基因或是其部分。这种复杂的整合模式通常会对整合核酸的表达水平具有不利的影响(例如，由于转录后基因沉默机制破坏转录的RNA，或者由于诱导整合DNA的甲基化)。同时，整合位点的位置通常也会影响被整合核酸的表达水平。而且，外源DNA的整合可能对发生整合的基因组区域产生破坏性影响，由此影响或干扰靶区域的正常功能，从而产生不良的副作用。上述因素的组合导致转基因或外源DNA的表达水平(和整体农艺品质)在不同的转基因植物细胞和植物系之间发生很大的变异，即便是它们是通过相同方法创建的。因为整合是随机的，所以在从业者试图产生具有期望特征的新植物时，这些影响不能够人为控制。上述考虑因素致使人们无论在任何时候研究将特定的外源核酸引入到植物中的效应时，都必须产生和分析大量的转基因植物品系以获得显著的结果。类似地，在产生含有特定整合核酸的转基因植物以提供具有期望表型的转基因植物时，必须创建独立创建的转基因植物品系的大群体，以便选择具有最佳核酸表达并对转基因植物的整体表型和性能具有最小或者没有副作用的植物品系。在通过插入多个外源核酸(即，基因堆叠)创建转基因植物时，这些实际的考虑因素具有更大的重要性。在这样的植物中，转录后基因沉默等现象会增多。为了控制植物中的转基因插入，已经开发出了多种方法。见例如KumarandFladung(2001)TrendsPlantSci.6:155-9。这些方法依赖基于同源重组的转基因整合，同源重组的转基因整合已经被成功地应用于原核生物和低等真核生物。Paszkowskietal.(1988)EMBOJ.7:4021-6。然而，直到最近，在植物中，转基因整合的主导机制仍然依赖于非常规重组(illegitimaterecombination)，其几乎不涉及重组DNA链之间的同源性。因此，这个领域中的主要挑战是检测和选择性产生罕见的同源重组事件，其会被效率高得多的通过非常规重组实现的整合事件所掩盖。而且，即使实现了对靶向的同源重组事件的选择性产生和检测，该事件也必须被靶向到宿主基因组的期望位置处方可实现这一策略的最大利益。例如，靶向遗传转化的一个推定的好处是，与通过随机整合获得的转化事件相比，转基因表达在事件与事件之间的变异性降低。另一个推定的好处是，显著减少在筛选引入核酸、分选转化构建体、和产生有助于在所得转基因植物中获得期望整体特征的事件中所需的事件数目。实现这些好处所需要的一个关键因素是鉴定基因组中这样的特定位置，在该位置上转基因性能是一致的，并且如果可能的话，在该位置上对宿主植物的不利影响被消除或最小化。最近，已经有人描述了用于靶向剪切基因组DNA的方法和组合物。这些靶向剪切事件能够用于，例如，诱导靶向突变，诱导细胞DNA序列的靶向删除，和促进在预定染色体基因座处的靶向重组和整合。见例如，Urnovetal.(2010)Nature435(7042):646-51；美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20090263900；20090117617；20100047805；20110207221；20110301073；2011089775；20110239315；20110145940；和国际公开WO2007/014275，本文通过提述并入其全部内容用于所有目的。剪切可以通过使用特异性核酸酶，例如工程化的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，或者使用具有引导特异性剪切的工程化crRNA/tracrRNA(‘单向导RNA’(singleguideRNA))的CRISPR/Cas系统而发生。美国专利公开No.20080182332描述了使用非规范(non-canonical)的锌指核酸酶(ZFNs)靶向修饰植物基因组；美国专利公开No.20090205083描述了植物EPSPS基因座的ZFN介导靶向修饰；美国专利公开No.20100199389描述了靶向修饰植物Zp15基因座，美国专利公开No.20110167521描述了靶向修饰参与脂肪酸生物合成的植物基因。此外，Moehleetal.(2007)Proc.Natl.Acad,Sci.USA104(9):3055-3060描述了使用设计的ZFN在特定的基因座处靶向添加基因。美国专利公开20110041195描述了制造纯合二倍体生物的方法。然而，仍然需要有用于修饰和/或调节植物FAD2基因表达的组合物和方法，包括产生在FAD2基因座处靶向插入期望转基因的植物。公开概述本公开描述了用于调节FAD2基因表达(例如在植物、藻类和真菌中)的组合物和方法，和这些基因座作为将感兴趣的核酸序列(例如外源核酸序列)靶向整合到宿主细胞内的位点的用途。在一些实施方案中，宿主细胞可能含有一个或多个基因组，所述基因组具有一个或多个FAD2序列(例如，同源物和/或旁系同源物)，其中任何一个或全部序列均可被选择性修饰和/或破坏。在具体的实施例中，本公开描述了大本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种位点特异性锌指蛋白，其结合这样的核酸靶位点，该靶位点包含SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:20的12、15或18个碱基对。
【技术特征摘要】
2012.09.07 US 61/697,8861.一种位点特异性锌指蛋白，其结合这样的核酸靶位点，该靶位点包含SEQIDNO:14至SEQIDNO:20的12、15或18个碱基对。2.权利要求1的锌指蛋白，其中该锌指蛋白包括3-6个锌指结构域，每个锌指结构域包括识别螺旋区，其中该锌指蛋白包括在表2的单一行中排序并显示的识别螺旋区。3.一种适用于修饰FAD2基因的锌指核酸酶，其包含权利要求1或权利要求2的锌指蛋白，以及核酸酶结构域。4.一种多核苷酸，其编码权利要求1或权利要求2的锌指蛋白，或权利要求3的锌指核酸酶。5.一种分离的植物细胞，其包含如权利要求1或权利要求2所述的锌指蛋白、如权利要求3所述的锌指核酸酶、或如权利要求4所述的多核苷酸。6.一种在大豆细胞中切割FAD基因的方法，该方法包括：将如权利要求3所述的锌指核酸酶或编码该核酸酶的多核苷酸导入大豆细胞，从而切割所述FAD2基因。7.权利要求6的方法，进一步包括将感兴趣的外源核酸序列整合到经切割的FAD2基因中。8.权利要求7的方法，其中所述感兴趣的外源核...
【专利技术属性】
技术研发人员：W·M·安利，S·R·韦布，P·塞缪尔，D·Y·古钦，J·C·米勒，L·张，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，桑格摩生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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