通过使用CD-RAP前体蛋白改善CD-RAP制备过程中的表达和折叠制造技术

本发明专利技术涉及一种包括前序列和CD‑RAP的CD‑RAP前体蛋白及其在制备天然CD‑RAP中的用途。本发明专利技术还涉及包括CD‑RAP和至少一种带正电荷氨基酸以及缓冲液的组合物、包括所述组合物的药物、它们在治疗和/或预防患有聚集蛋白聚糖降解和/或水流入软骨增加和/或CD‑RAP表达减少的患者的软骨疾病或损伤的方法中的用途，以及产生所述组合物的方法和将CD‑RAP储存在所述组合物中的方法。本发明专利技术还涉及包括脂质体的组合物，该脂质体包括囊封的CD‑RAP或其变体，该组合物在治疗关节疾病或损伤的方法中的用途，以及产生这种脂质体组合物的方法和在其中储存CD‑RAP的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过使用CD-RAP前体蛋白改善CD-RAP制备过程中的表达和折叠本专利技术涉及一种包括前序列和CD-RAP的CD-RAP前体蛋白及CD-RAP前体蛋白在制备天然CD-RAP中的用途。本专利技术还涉及包括CD-RAP和至少一种带正电荷氨基酸以及缓冲液的组合物、包括所述组合物的药物、它们在治疗和/或预防患有聚集蛋白聚糖降解和/或水流入软骨增加和/或CD-RAP表达降低减的患者的软骨疾病或损伤的方法中的用途，以及产生制所述组合物的方法和将CD-RAP储存在所述组合物中的方法。本专利技术还涉及包括脂质体的组合物，该脂质体包括囊封的CD-RAP或其变体，该组合物在治疗关节疾病或损伤的方法中的用途，以及产生这种脂质体组合物的方法和将在其中储存CD-RAP储存在的方法。
技术介绍
骨关节炎(OA)是一种高度流行的退行性关节疾病，发展非常缓慢。OA的标志特是关节软骨的破坏(软骨基质中蛋白多糖和胶原的损失)，伴随着骨赘(沿着关节边缘的骨突起)的潜在骨形成的损伤害和滑膜的改变，导致关节炎症(滑膜炎)。总之，这些过程引起患病关节的疼痛、错位和功能丧失。骨关节炎的特征是关节软骨的损失，导致疼痛和功能丧失，通常发生在膝盖和臀部，并且影响到美国、日本、法国、德国、意大利和西班牙七个主要市场的8140万个体(数据监测报告DMHC2493，2009年12月)。在美国，疾病控制和预防中心(CDC)报告，总体上，OA影响到13.9％的25岁及以上成年人和33.6％(1240万)的65岁以上成年人(估计2005年美国成年人从1990年2100万上涨为2690万)。预计到2020年，寿命预期和老龄人口的增加将使骨关节炎成为残疾的第四大主要原因(AnthonyD.Woolf&BrucePfleger，Burdenofmajormusculoskeletalconditions，BulletinoftheWorldHealthOrganization2003；81:646-656)。从医学角度来看，OA还与其他慢性疾患相关，诸如体重过重、糖尿病、高血压、血脂异常和冠状动脉疾病，这些疾病造成诊断为OA的受试者对的多重发病率。目前，在排除置换手术的情况下，不能没治愈OA，可用的治疗旨在缓解症状和改善功能。这些包括患者教育、物理治疗、体重控制和药物使用(营养补充剂、单纯镇痛剂、局部NSAIDS、口部NSAIDS、cox-2抑制剂和口服类固醇、关节内施用给的类固醇和透明质酸)的组合。过去曾多次尝试抑制主要参与软骨降解的那些酶的活性。不幸的是，迄今为止几乎没有成功。抗蛋白酶治疗缺乏所需的效力和临床效益(LewisEJ，BishopJ，BottomleyKM，BradshawD，BrewsterM，BroadhurstMJ等。Ro32-3555，anorallyactivecollagenaseinhibitor，preventscartilagebreakdowninvitroandinvivo。BrJPharmacol1997；121:540–6；BrownPD.。Ongoingtrialswithmatrixmetalloproteinaseinhibitors。ExpertOpinInvestigDrugs2000；9:2167-77)，没有足够的生物利用度或口服活性和/或对靶标酶缺乏特异性。具体地，MMP抑制剂显示出剂量和持续时间依赖性的肌肉骨骼副作用，肌肉骨骼副作用由关节僵直、关节纤维增生和I型胶原在骨关节炎关节中的积累组成(RenkiewiczR，QiuL，LeschC，SunX，DevalarajaR，CodyT等人。Broad-spectrummatrixmetalloproteinaseinhibitormarimastat-inducedmusculoskeletalsideeffectsinrats。ArthritisRheum2003；48:1742–9；RaoBG。RecentdevelopmentsinthedesignofspecificMatrixMetalloproteinaseinhibitorsaidedbystructuralandcomputationalstudies。CurrPharmDes2005；11:295–322)。随着患有这种疾病的患者的数目的不断增加，新的治疗方法是非常理想的，并且非常受欢迎，其具有较小的创伤性，不仅缓解症状，而且改善疾病或损伤的潜在原因，即软骨的降解。随着患有这种疾病的患者的数目的不断增加，新的治疗方法是非常理想的，并且非常受欢迎，其具有较小的创伤性，不仅缓解症状，而且改善疾病或损伤的潜在原因，即软骨的降解。治疗性蛋白CD-RAP已显示出能减缓软骨的降解，以及促进受损软骨的再生。然而，为了作为充足的药物供应的来源，CD-RAP还需要满足产生中高产率的商业要求。因此，希望采用重组DNA技术产生CD-RAP。通过在强细菌启动子的控制下表达编码CD-RAP的基因，重组细菌工艺方可以解决这一问题。细菌的直接表达需要位于位置-1处的甲硫氨酸以起开始翻译。密码子必须添加到编码CD-RAP序列的序列中。天然CD-RAP包含位于其序列第3位置的甲硫氨酸。在表达期间，该甲硫氨酸也可用于翻译起始。因此可以观察到两种表达产物，一种以甘氨酸开始以产生天然CD-RAP，另一种以脯氨酸开始以产生CD-RAP的截短形式。对迄今可用的CD-RAP制剂的分析表明，这些制剂实际上含有至少三种不同的CD-RAP种类。特别地，CD-RAP的氨基末端，例如在大肠杆菌中表达的氨基末端，对降解敏感，导致CD-RAP产物的约10％N-末端异质性。通过在大肠杆菌中表达获得的CD-RAP包含至少以下三种不同的蛋白质种类：a)具有额外的N-末端甲硫氨酸(即总共108个氨基酸)的CD-RAP(108AA)，其是主要种类(≥90％)并且具有N-末端：MGPMPKL...b)由没有额外的N-末端甲硫氨酸且具有N-末端GPMPKL...的成熟CD-RAP序列组成的CD-RAP(107AA)，以及c)CD-RAP(105AA)，其是具有N-末端序列：MPKL...，即比成熟的CD-RAP序列少两个氨基酸的N-末端截短的CD-RAP。产物中的这种异质性是不希望的，因为降低产率的进一步的纯化步骤是必需的。如果不在翻译后定量去除F-甲硫氨酸，异质性可能变得甚至更高。此外，天然CD-RAP显示出高疏水性，由于其对细胞的相对毒性，导致其在细菌中的表达受到限制。CD-RAP的重组表达还需要在蛋白表达之后折叠蛋白。然而，发现天然CD-RAP的折叠产率非常低，部分原因是高疏水性。为了克服CD-RAP产生中的这些问题，设计了具有前序列的CD-RAP融合蛋白，这导致在该前体CD-RAP蛋白表达中的高产率，这可能是，除其他以外，由于前体蛋白疏水性降低。此外，发现融合蛋白的折叠比天然CD-RAP的折叠容易得多。然而，为了在折叠后构成天然CD-RAP，必须通过酶切去除前序列。为了实现这一点，天然CD-RAP的氨基酸序列与前序列之间的连接处被设计为切割位点，特别是作为内切蛋白酶的切割位点。总的来说，与没有前序列的表达相比较，CD-RAP的生产率在用前序列表达和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CD‑RAP前体蛋白，包括a)前序列，所述前序列包括在其C‑末端的切割位点，以及b)CD‑RAP或其变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.18 EP 15306457.1;2015.09.18 EP 15306458.9;1.一种CD-RAP前体蛋白，包括a)前序列，所述前序列包括在其C-末端的切割位点，以及b)CD-RAP或其变体。2.一种核酸，编码根据权利要求1所述的前体CD-RAP蛋白。3.一种载体，包括根据权利要求2所述的核酸。4.一种宿主细胞，包括根据权利要求1所述的前体CD-RAP蛋白、根据权利要求2所述的核酸或根据权利要求3所述的载体。5.一种产生天然CD-RAP的方法，包括以下步骤a)提供根据权利要求1所述的CD-RAP前体蛋白，以及b)去除所述前序列以获得天然CD-RAP。6.一种CD-RAP蛋白制剂，包括具有长度为107个氨基酸的SEQIDNO：1的成熟CD-RAP序列的CD-RAP蛋白，其中所述CD-RAP(107AA)与存在于所述CD-RAP蛋白制剂中的任何其他CD-RAP蛋白的比率为≥99wt-％。7.一种组合物，包括CD-RAP或其变体，和至少一种带正电荷氨基酸以及缓冲液。8.一种产生根据权利要求7所述的组合物的方法，包括将CD-RAP或...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊莎贝尔·舍特勒，尤迪特·斯托姆梅斯，保罗·哈伯曼，贝恩德·亚诺哈，乌尔苏拉·施蒂尔格，埃卡特·巴特尼克，福尔克尔·耶斯克，约阿希姆·扎斯，
申请(专利权)人：生命制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE