耐药结核靶标蛋白RecA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种耐药结核靶标蛋白RecA及其应用。本发明专利技术公开了与分枝杆菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性相关的蛋白RecA以及它的应用。本发明专利技术通过pull‑down的生物学方法垂钓得到靶标蛋白RecA，并对其功能进行验证。本发明专利技术发现蛋白RecA可以通过与喹诺酮类药物的靶标蛋白DNA旋转酶相互作用，抑制DNA旋转酶的部分功能，使超螺旋型的质粒pUC19‑BbvcⅠ的数量减少；在加入药物CIP时，能够影响DNA旋转酶的功能使线性质粒pUC19‑BbvcⅠ的数量减少，从而减弱药物的抑制作用。因此，蛋白RecA将为新药的研发提供更多的选择。

Target protein RecA of drug-resistant tuberculosis and its application

The invention discloses a drug-resistant tuberculosis target protein RecA and its application. The invention discloses a protein RecA related to the resistance of Mycobacterium to fluoroquinolones and its application. The target protein RecA is obtained by pull down biological method and its function is verified. The present invention has found that protein RecA can inhibit some functions of DNA rotatase by interacting with the target protein DNA rotatase of quinolones, reduce the number of superhelix plasmid pUC19_Bbvc_, and influence the function of DNA rotatase by adding CIP, and reduce the number of linear plasmid pUC19_Bbvc_. Thereby reducing the inhibitory effect of drugs. Therefore, protein RecA will provide more choices for the development of new drugs.

【技术实现步骤摘要】
耐药结核靶标蛋白RecA及其应用
本专利技术涉及一种耐药结核靶标蛋白RecA及其应用。
技术介绍
肺结核(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)引起的影响人类生命健康的重大疾病之一，而随着耐药结核的出现使得结核病的治疗更加困难。氟喹诺酮类药物是治疗耐药结核的药物之一，它们的作用靶点是DNA旋转酶(Gyrase)。针对肺结核耐药机制的研究持续不断，目前有关其相互作用蛋白方面的研究相对较少，因此通过对其相互作用蛋白的研究将对其耐药机制做出进一步的阐释，以及对新型结核药物的研发提供更多的理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耐药结核靶标蛋白RecA及其应用。本专利技术保护用于抑制RecA蛋白表达的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为抑制分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性。本专利技术还保护用于抑制分枝杆菌中的RecA蛋白与DNA旋转酶结合的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为抑制分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性。本专利技术还保护一种产品，其活性成分为用于抑制RecA蛋白表达的物质；所述产品的用途为抑制分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性。本专利技术还保护一种产品，其活性成分为用于抑制分枝杆菌中的RecA蛋白与DNA旋转酶结合的物质；所述产品的用途为抑制分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性。本专利技术还保护一种产品，包括用于抑制RecA蛋白表达的物质和氟喹诺酮类药物；所述产品的用途为治疗结核病。本专利技术还保护一种产品，包括用于抑制分枝杆菌中的RecA蛋白与DNA旋转酶结合的物质和氟喹诺酮类药物；所述产品的用途为治疗结核病。本专利技术还保护RecA蛋白作为靶点，在筛选或开发结核病治疗药物中的应用。本专利技术还保护RecA蛋白作为靶点，在筛选或开发用于抑制分枝杆菌的药物中的应用。以上任一所述抑制RecA蛋白表达的物质具体为抑制分枝杆菌中RecA蛋白表达的物质。以上任一所述氟喹诺酮类药物具体可为环丙沙星。以上任一所述结核病为由分枝杆菌引起的结核病，具体可为肺结核。以上任一所述RecA蛋白如序列表的序列3所示。所述RecA蛋白的编码基因如序列表的序列2所示。以上任一所述分枝杆菌具体可为结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌。本专利技术公开了与分枝杆菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性相关的蛋白RecA以及它的应用。本专利技术通过pull-down的生物学方法垂钓得到靶标蛋白RecA，并对其功能进行验证。本专利技术发现蛋白RecA可以通过与喹诺酮类药物的靶标蛋白DNA旋转酶相互作用，抑制DNA旋转酶的部分功能，使超螺旋型的质粒pUC19-BbvcⅠ的数量减少；在加入药物CIP时，能够影响DNA旋转酶的功能使线性质粒pUC19-BbvcⅠ的数量减少，从而减弱药物的抑制作用。因此，蛋白RecA将为新药的研发提供更多的选择。附图说明图1为实施例1中SDS-PAGE检测结果，图2为通过体外垂钓实验验证蛋白GST-RecA和蛋白Strep-His–GyrBA(DNA旋转酶)相互作用。图3为Western印迹鉴定蛋白RecA和DNA旋转酶之间的相互作用。图4为蛋白RecA对DNA旋转酶产生影响。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pMV261载体：参考文献：StoverCK,VfDLC,FuerstTR,etal.NewuseofBCGforrecombinantvaccines[J].Nature,1991,351(6326):456-460.；公众可以从中国科学院微生物研究所获得。耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞：参考文献：GORDON,RE；SMITH,MM(July1953)."Rapidlygrowing,acidfastbacteria.I.Species'descriptionsofMycobacteriumphleiLehmannandNeumannandMycobacteriumsmegmatis(Trevisan)LehmannandNeumann".Journalofbacteriology66(1):41–8.PMC357089.PMID13069464；公众可从中国科学院微生物研究所获得。环丙沙星：CAS号：85721-33-1，分子式：C17H18FN3O3。pGEX-5X-3载体：派瑞金(北京)生物科技有限公司，货号：09228230。pACYC-Duet-1载体：派瑞金(北京)生物科技有限公司，货号：09228129。超螺旋质粒pUC19-BbvcI：参考文献：BlowerTR,WilliamsonBH,KernsRJ,etal.Crystalstructureandstabilityofgyrase-fluoroquinolonecleavedcomplexesfromMycobacteriumtuberculosis.[J].ProcNatlAcadSciUSA,2016,113(7):1706-1713.；公众可从中国科学院微生物研究所获得。质粒pET-28a(+)：上海翊圣生物科技有限公司，货号：11905ES03。实施例1、耐药结核靶标蛋白RecA的获得一、过表达重组载体的构建将pMV261载体的DraI和HindIII酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列1所示的双链DNA分子，得到重组表达载体pMV261-Np-his-strep-gryB-gyrA。序列1所示的双链DNA分子中，自5’端第1-559位为Np，第560-2584位为gryB，第2585-2620位为his-strep–tag，第2653-5181位为gyrA。二、靶标蛋白的捕获1、将步骤一制备的重组表达载体pMV261-Np-his-strep-gryB-gyrA导入耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞，得到重组菌。2、将步骤1得到的重组菌接种于2mL的7H9液体培养基中，37℃、200r/min摇床振荡培养48h。3、完成步骤2后，将重组菌菌液按照1/100的比例转接于200mL的7H9(全)液体培养基中，37℃、200r/min摇床振荡培养至菌液OD600nm＝1.0。4、完成步骤3后，将重组菌菌液按照1/100的比例转接于两瓶500mL的7H9(全)液体培养基中，37℃、200r/min摇床振荡培养至菌液OD600nm＝2.0。5、完成步骤4后，一瓶中加入环丙沙星(在培养体系中的浓度为0.25μɡ/mL)，37℃、200r/min摇床振荡培养30min。6、完成步骤5后，将培养体系4℃、8000rpm离心20min收集菌体，用适量裂解缓冲液悬浮并加入苯甲基磺酰氟(PMSF，CAS号：329-98-6，分子式：C7H7FO2S)，4℃超声(190W)40min。裂解液：分别称取磷酸二氢钾(KH2PO4，CAS号：7778-77-0)0.27g，氯化钠(NaCl，CAS号：7647-14-5)8g，氯化钾(KCl，CAS号：7447-40-7)0.2g，十二水合磷酸氢二钠(Na2HP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于抑制RecA蛋白表达的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为抑制分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性。

【技术特征摘要】
1.用于抑制RecA蛋白表达的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为抑制分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性。2.用于抑制分枝杆菌中的RecA蛋白与DNA旋转酶结合的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为抑制分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性。3.一种产品，其活性成分为用于抑制RecA蛋白表达的物质；所述产品的用途为抑制分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性。4.一种产品，其活性成分为用于抑制分枝杆菌中的RecA蛋白与DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：米凯霞，管玉周，冯立鹏，周怡璇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，安徽大学，
类型：发明
国别省市：北京,11