抗CD30的单克隆抗体、其杂交瘤细胞株、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了抗CD30的单克隆抗体、其杂交瘤细胞株、制备方法及应用。该杂交瘤细胞株通过原核表达的CD30蛋白免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得，该抗CD30的单克隆抗体能特异性地识别CD30蛋白，并与肿瘤细胞有较强反应性，可应用于诊断或者治疗肿瘤，其包含于一种用于诊断或者治疗肿瘤的制剂中，本发明专利技术还公开了CD30蛋白原核表达方法、所用表达基因序列、杂交瘤细胞株及抗CD30的单克隆抗体的制备方法。本发明专利技术通过免疫CD30蛋白，制备了抗CD30杂交瘤细胞株，可以分泌抗CD30的特异性单克隆抗体，与肿瘤细胞有较强反应性，可应用于肿瘤的诊断和治疗。

【技术实现步骤摘要】
抗CD30的单克隆抗体、其杂交瘤细胞株、制备方法及应用
本专利技术属于生物医药工程
，具体涉及抗CD30的单克隆抗体、其杂交瘤细胞株、制备方法及应用。
技术介绍
外周T细胞淋巴瘤(PeripheralT-celllymphoma，PTCL)是来源于胸腺不同阶段的T细胞、生物学行为及临床表现有明显异质性的一类恶性淋巴肿瘤，其发病具有地域和种族的差异，PTCL在西方国家仅占NHL的6％-7％，以淋巴结性淋巴瘤发生率较高，包括PTCL-U、ALCL和血管免疫母细胞淋巴瘤(AlTL)；而在亚洲国家PTCL常见，占NHL的15％-30％，以结外淋巴瘤多见。由于PTCL的发生率逐年上升，2007年美国国家癌症综合网(NCCN)指南首次列入PTCL。这表明西方国家已经开始关注和重视PTCL的诊断和治疗。大量研究表明CD30是淋巴瘤主要的肿瘤标志物之一，CD30是一种分子量120KDa的细胞表面糖蛋白，于上世纪80年代被Stein报道并描述。1992年，编码人类CD30的cDNA被成功克隆，从而确认CD30属于NGFR/TNFR超家族的一员。研究发现CD30可以参与细胞活化和分化，参与NF-kB等活化信号的传导，以及T细胞免疫的激活过程中。在霍奇金淋巴瘤(HL)发病过程中，CD30的表达可显著升高，在与其他因素的共同作用下，对CD8+和CD4+Th2细胞的活化具有很强的促进作用研究发现，在多种病理状态下CD30表达量显著增加。Smith等相关研究发现在HL中有CD30表达的增高，Watanabe等也通过细胞培养等方法，发现CD30在包括HL在内的多种淋巴瘤中表达是增高的。许多研究发现CD30在PTCL中高表达。Bossard研究报道，采用免疫组织化学方法(IHC)检测发现50％的PTCL病人表达可检测到CD30。自1997年美国食品药品监督管理局(FDA)批准的第一个单克隆抗体药物利妥昔单抗(Rituximab)用于肿瘤治疗后，基于抗体的免疫治疗逐渐成为该领域的重要策略之一。针对CD30的抗体研究始于20世纪90年代初，目前已有两种针对CD30的药物，Iratumumab(SGN-30)和Brentuximabvedotin(SGN-35)。Iratumumab是针对CD30的治疗抗体，对CD30阳性的HL病人有一定的疗效。Brentuximabvedotin是CD30抗体和monomethylauristatin组成的微管抑制剂的免疫交联物，FDA已批准Brentuximabvedotin治疗复发性和难治性CD30阳性的HL病人。在一项Brentuximabvedotin治疗PTCLⅡ期多中心临床试验中显示，总缓解率为86％，完全缓解率为53％。在另一项I/Ⅱ期研究中，研究者评估了brentuximabvedotin用于CHOP后续治疗或与CHP联合一线治疗CD30+PTCL的安全性和有效性。结果显示：患者总缓解率为73％-85％，完全缓解率为35％-62％，62％的患者发生3/4级不良反应，不良反应包括发热性中性粒细胞减少症。CD30是恶性血液肿瘤的一个重要分子靶点，获得高效价、高特异性的抗CD30的单克隆抗体是研发新型抗CD30抗体药物偶联物的前提，该偶联物的成功研发将为我国提供一种具有自主知识产权的新型淋巴瘤候选药物。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。因此，作为本专利技术其中一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种杂交瘤细胞株。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种杂交瘤细胞株，其在武汉大学中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：C201861。作为本专利技术所述杂交瘤细胞株的优选方案：所述杂交瘤细胞株是抗CD30的杂交瘤细胞株，所述CD30蛋白为原核表达的重组蛋白，命名为原核表达CD30蛋白。作为本专利技术所述杂交瘤细胞株的优选方案：所述杂交瘤细胞株是通过原核表达的CD30蛋白免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得。作为本专利技术的另一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种抗CD30的单克隆抗体。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种抗CD30的单克隆抗体，其是由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌所得。作为本专利技术所述的抗CD30的单克隆抗体的优选方案：所述抗CD30的单克隆抗体的亚类属于IgG1，所述抗CD30的单克隆抗体能特异性地识别CD30蛋白，并与肿瘤细胞具有强反应性，1mg/ml浓度的所述抗CD30单克隆抗体在CD30用量为2.5ng时，抗体效价达到1:640000。作为本专利技术的另一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供权利要求4或5所述的抗CD30的单克隆抗体在制备诊断或治疗肿瘤的药物制剂中的应用。作为本专利技术的另一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种用于诊断或者治疗肿瘤的药物制剂，其包括权利要求4或5所述的抗CD30的单克隆抗体。作为本专利技术的另一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供权利要求4或5所述抗CD30的单克隆抗体的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：权利要求4或5所述抗CD30的单克隆抗体的制备方法，其包括，原核表达CD30蛋白及纯化：设计引物，构建pET-28a-CD30原核表达质粒，鉴定正确的质粒转化入BL21中，以IPTG诱导表达蛋白；IPTG诱导的菌液超声波裂解，取离心后的上清与Ni填料结合后洗脱蛋白，获得纯化的CD30蛋白，蛋白分子量大小约为40KDa；制备杂交瘤细胞株：将经过纯化的所述CD30蛋白乳化，多点注射加腹腔注射于Balb/c小鼠，多点注射CD30蛋白的量为50μg/鼠，注射次数为2次，时间间隔为2周，第二次多点注射加腹腔注射完成的4天后，尾静脉注射CD30蛋白的量为50μg/鼠；取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；筛选阳性的杂交瘤细胞株并扩大培养。作为本专利技术所述抗CD30的单克隆抗体的制备方法，其还包括，抗CD30的单克隆抗体的制备：将权利要求8获得的阳性杂交瘤细胞株注射于Balb/c小鼠腹腔内使所述小鼠产生腹水，收集腹水；抗CD30的单克隆抗体的纯化：用protein-G柱亲和纯化，得到抗CD30的单克隆抗体。本专利技术的有益效果：本专利技术通过免疫CD30原核表达蛋白，制备了抗CD30杂交瘤细胞株，可以分泌相应的单克隆抗体，能特异性地识别CD30蛋白，并与肿瘤细胞有较强反应性，可应用于肿瘤的诊断和治疗，本专利技术制备的CD30单克隆抗体，1mg/ml浓度的CD30单克隆抗体在CD30量为2.5ng/孔时，抗体效价达到1:640000，纯化后的单克隆抗体经SDS-PAGE鉴定，条带清晰，无杂带，在50KDa和25KDa处各有清晰的条带，分别代表抗体的重链和轻链。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株，其在武汉大学中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：C201861。

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株，其在武汉大学中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：C201861。2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株是抗CD30的杂交瘤细胞株，所述CD30蛋白为原核表达的重组蛋白，命名为原核表达CD30蛋白。3.根据权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株是通过原核表达的CD30蛋白免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得。4.一种抗CD30的单克隆抗体，其特征在于：由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌所得。5.根据权利要求4所述的抗CD30的单克隆抗体，其特征在于：所述抗CD30的单克隆抗体的亚类属于IgG1，所述抗CD30的单克隆抗体能特异性地识别CD30蛋白，并与肿瘤细胞具有强反应性，1mg/ml浓度的所述抗CD30单克隆抗体在CD30用量为2.5ng时，抗体效价达到1:640000。6.权利要求4或5所述的抗CD30的单克隆抗体在制备诊断或治疗肿瘤的药物制剂中的应用。7.一种用于诊断或者治疗肿瘤的药物制剂，其特征在于：包括权利要求4或5所述的抗CD30的单克...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯继锋，吴建中，马蓉，
申请(专利权)人：江苏省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32