一种虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术的一株虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株FB12‑1已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14690，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。以细胞株FB12‑1分泌的抗体7H6为包被抗体，抗体7H6标记HRP后为酶标抗体(7H6‑HRP)，以虾原肌球蛋白为标准品建立了检测虾原肌球蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法，在检测食品过敏原中的应用，具有实际应用价值。

Hybridoma cell of monoclonal antibody of shrimp myosin and its application

The invention discloses a shrimp myosin monoclonal antibody hybridoma cell and its application, belonging to the food safety immunoassay field. The hybridoma cell strain FB12 1 of the original myosin monoclonal antibody of the shrimp was preserved in the general microbiological center of the Chinese microbe preservation management committee in September 5, 2017, and the preservation number is CGMCC No.14690. The preservation address is No. 3, No. 1, No. 1, Beichen West Road, Beijing City, and the Chinese Academy of Sciences It is. The antibody 7H6, which was secreted by the cell line FB12 1, was a inclusion antibody, and the antibody 7H6 was labeled as an enzyme labeled antibody (7H6 HRP). A double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting the myosin of prawns was established. It was used in the detection of food allergen. It was of practical value.

【技术实现步骤摘要】
一种虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用
本专利技术涉及一种虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用，属于食品安全免疫检测

技术介绍
近年来,食物过敏已成为一个公众性的食品安全问题。食物过敏是人类常见的一种免疫性疾病，主要是由食物中蛋白质引起，由IgE介导的Ⅰ型超敏反应，其临床症状主要有水肿、皮炎、哮喘以及肠道综合症等，严重时会引发休克甚至危及生命，复杂食物样品中微量过敏原的检测和定量成为当务之急。甲壳类动物是联合国粮农组织提出的8大类易过敏食物之一，甲壳类动物主要过敏原为分子质量约为36-38kDa的虾原肌球蛋白。目前体外针对微量过敏原的检测方法有免疫学方法、蛋白组学法、PCR法、化学发光免疫方法。虽然目前有关过敏原检测的方法很多,但都存在各自不同的问题,如检测速度慢、成本高、检测需要特定的分析仪器等,制约了食品中过敏原检测方法的发展。因此实现准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏的体外检测技术方法具有现实意义。与其他过敏原检测方法相比，酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆单体是重要前提。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，建立检测虾原肌球蛋白的双抗体夹心ELISA法。本专利技术的第一个目的是提供一种虾原肌球蛋白单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号为CGMCCNo.14690，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术的第二个目的是提供一种虾原肌球蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNo.14690的单克隆细胞株分泌产生。本专利技术的第三个目的是提供虾原肌球蛋白单克隆抗体的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是用于食品中虾原肌球蛋白的分析检测。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是用于制备ELISA竞争法检测虾原肌球蛋白的试剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是以所述的虾原肌球蛋白单克隆抗体为包被抗体，抗体标记HRP后为酶标抗体，建立检测虾原肌球蛋白的双抗体夹心ELISA法，用此建立的双抗夹心法检测食品中虾原肌球蛋白，检测限为0.9ng/ml，具有实际应用价值。本专利技术的第四个目的是提供制备所述虾原肌球蛋白单克隆细胞株的方法，是用虾原肌球蛋白免疫动物，从动物体内分离多克隆抗体。在本专利技术的一种实施方式中，所述虾原肌球蛋白杂交瘤细胞株的制备方法基本步骤为：(1)虾原肌球蛋白过敏原的制备：制备虾蛋白浸提液、饱和硫酸铵分级沉淀、SDS-PAGE鉴定虾原肌球蛋白、凝胶过滤层析分离得到高纯度蛋白。(2)动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠，首次免疫用100μg虾原肌球蛋白与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg虾原肌球蛋白与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量虾原肌球蛋白加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，用虾原肌球蛋白作为包被抗原，通过直接ELISA法检测血清效价；其具体ELISA程序如下：1)包被：将包被抗原用0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2h；2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μLPBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃孵育2h，洗涤后烘干备用；4)加样：将抗血清从1:1000开始梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液(TMB与底物液体积比例1:5)，37℃避光反应15min；6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液(2mol/L的硫酸)终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值OD450nm。(3)细胞融合与筛选：在冲击免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为1450)方法进行细胞融合，具体步骤如下：a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；c、将脾细胞和SP2/0细胞按照10:1(数量比)的比例混合，离心后用50％PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天用含20％胎牛血清、1％100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。筛选：用虾原肌球蛋白作为包被抗原，用直接ELISA进行检测，选取细胞团数少且阳性高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即得到能稳定分泌虾原肌球蛋白单克隆抗体的细胞株。(4)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。本专利技术还提供含有所述虾原肌球蛋白单克隆抗体的组合物。本专利技术还提供用于虾原肌球蛋白检测的试剂盒，含有所述的单克隆抗体、固相载体，用于包被所述固相载体的抗体，能与检测抗原结合的酶标抗体，显色底物，洗涤液和封闭液；所述用于包被所述固相载体的抗体为杂交瘤细胞CGMCCNo.14690分泌的单克隆抗体。本专利技术的有益效果：本专利技术获得了能够分泌虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，建立了检测虾原肌球蛋白的双抗体夹心ELISA法，在检测食品过敏原中的应用，具有实际应用价值。生物材料保藏单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14690，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。附图说明图1是本专利技术获得的虾原肌球蛋白检测曲线方程y＝0.22904+0.53319x(R2＝0.9937)的示意图。具体实施方式本专利技术通过将完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过直接ELISA筛选细胞上清，将筛选得到的效价高的虾原肌球蛋白细胞株扩大培养，并经过腹水制备以及纯化，并用双抗体夹心法两两配对，最终建立了虾原肌球蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法。实施例1虾原肌球蛋白的单克隆抗体制备1、虾原肌球蛋白过敏原的制备：a、虾蛋白浸提液制备：称取虾仁20g，组织捣碎机处理得虾肉泥。虾肉泥按1:10(W/V)浸入石油醚(60～90)中脱脂，4℃磁力搅拌下过夜，6000r/mim离心15min，弃上清，沉淀置于通风橱使石油醚挥发得脱脂虾肉。随即按1:20(W/V)浸入0.05MpH7.4PBS中浸提过夜，浸提液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种虾原肌球蛋白单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14690，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

【技术特征摘要】
1.一种虾原肌球蛋白单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14690，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。2.一种虾原肌球蛋白单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的保藏编号为CGMCCNo.14690的单克隆细胞株分泌产生。3.权利要求2所述的虾原肌球蛋白单克隆抗体的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于食品中虾原肌球蛋白的分析检测。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于制备ELISA竞争法检测虾原肌球蛋白的试剂。6.权利要求3所述的应用，其特征在于：以权利要求2所述的抗体为包被抗体，抗体标记HRP后为酶标抗体，建立检测虾原肌球蛋白的双抗体夹心ELISA法。7.制备权利要求1所述单克隆细胞株的方法，其特征在于，用虾原肌球蛋白免疫动物，从动物体内分离多克隆抗体。8.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，曾露，胥传来，徐丽广，刘丽强，宋珊珊，吴晓玲，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32