一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，具体是一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学‑药效学中的应用，包括制备清醒大鼠在体微透析取样装置采集血液透析液，采用高效液相色谱‑三重四级杆质谱方法分析血液透析液中活性成分的药物浓度，并采用高效液相色谱‑荧光检测技术测定血液透析液中药效指标NO。本发明专利技术采用清醒大鼠在体微透析技术，克服了动物麻醉和血液量损失对药动学和药效学行为的影响，成功地运用于生脉注射液抗大鼠心肌缺血的血药浓度‑时间和药效‑时间关系研究，并建立了药动学‑药效学结合模型。本发明专利技术研究表明，当选择合适的血液内源性生物标记物作为药效指标，清醒动物在体微透析采样技术将成为药动学‑药效学结合研究的理想工具。

【技术实现步骤摘要】
一种血液透析液检测方法及其在生脉注射液药动学-药效学中的应用
本专利技术涉及医药
，具体地说，是一种清醒大鼠在体微透析采样技术结合透析液检测方法，用于研究异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌缺血大鼠给药生脉注射液后的药动学-药效学相关性。
技术介绍
生脉注射液是由红参、麦冬、五味子三味中药组成的复方制剂，在临床上广泛用于治疗心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等症，是一种确有疗效的中药注射剂。药理研究表明，生脉注射液具有对心肌氧化损伤的抗氧化保护活性，增加冠脉血流量，降低心肌耗氧量，改善心肌能量代谢，增加心肌收缩力，降低外周阻力，提高机体抗缺氧能力等药理作用。生脉注射液虽然临床应用广泛，但是关于其体内药代动力学以及药动学-药效学结合研究还非常薄弱，因此以生脉注射液多种活性成分为药代标记物，选择合适的生物标记物作为药效指标，分析血药浓度-时间和药效-时间关系并建立药动学-药效学结合模型，对于指导药物的二次开发以及生脉注射液的临床合理用药十分必要。微透析技术能够实时、在线对实验动物进行连续采样，其活体微创、动态观察、定量分析、采样量小的特点特别适合于研究生物体内源性物质和外源性药物的动态变化过程，所以在过去的几十年里，微透析采样技术在临床前和临床药动学、药效学和药动学-药效学结合研究领域得到了广泛的应用。但是纵观文献，目前微透析采样技术用于药动学-药效学结合研究还存在着一些明显的技术局限。其中，最主要的问题包括：微透析技术用于药动学-药效学结合研究大多基于动物麻醉状态；另外，大多研究采用的是微透析采样与血液采集相结合的方法分别用于开展药动学和(或)药效学研究。有研究表明动物麻醉以及动物血液量的损失会显著地影响药物的药动学和药效学行为。
技术实现思路
为了解决以上问题，本专利技术建立了一种清醒大鼠在体微透析采样技术用于采集异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌缺血大鼠给药生脉注射液后的血液透析液，并建立了高效液相色谱-三重四级杆质谱方法(HPLC-MS/MS)和高效液相色谱-荧光检测技术(HPLC-FLU)分别用于测定透析液中的多成分药物浓度和药效指标NO的变化。所建立的方法无需采取大鼠血液，只采集大鼠血液透析液，同时用于测定药物浓度和药效指标的变化。本专利技术的第一方面，提供一种清醒大鼠在体微透析采样技术，具体步骤如下：手术前，大鼠腹腔注射5％水合氯醛生理盐水溶液(0.25g/kg体重)，保持在整个手术过程大鼠处于麻醉状态。手术过程采用体温维持仪控制大鼠体温为37℃。施行静脉分离手术，暴露右侧外颈静脉，在外颈静脉与腋静脉交叉处上游约10mm处用手术剪在血管上表面剪出一小口，迅速将事先浸润肝素钠溶液的同轴型探针向心房方向插入血管中，用丝线将探针与血管固定在一起，防止探针滑脱(见图1)。在大鼠颈背部开一小口，将探针的进出口端导管在穿刺针引导下沿皮下从颈背部引出，再用医用手术缝合针线缝合各伤口，并擦上医用碘酒消毒。最后将大鼠置于清醒装置中，并联接上微透析系统各导管，开通微量注射泵以2μL/min流速灌流生理盐水溶液。恢复约12h后，大鼠可自由活动。本专利技术的第二方面，提供一种血液微透析技术用于生脉注射液药动学-药效学结合研究的方法，其采用微透析取样技术结合高效液相色谱-三重四级杆质谱分析方法和高效液相色谱-荧光检测技术。具体包括以下步骤：模型大鼠颈静脉埋植微透析探针后，置于清醒动物装置中；尾静脉注射给药生脉注射液后，收集0～12h内不同时间点的透析液；将上述透析液分别采用高效液相色谱-三重四级杆质谱方法分析多成分药物浓度；并采用高效液相色谱-荧光检测技术测定透析液中药效指标NO；绘制模型大鼠给药生脉注射液后活性成分血药浓度-时间曲线图和药效-时间曲线图；根据血药浓度-时间关系和药效-时间关系建立药动学-药效学结合模型。本专利技术的第三方面，提供一种给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，包括以下步骤：采用HPLC-MS/MS方法分析血液透析液中的活性成分血药浓度，同时采用HPLC-FLU测定血液透析液中药效指标NO；所述的活性成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rc；所述的药效指标NO通过测定透析液中NO2－和NO3－总含量获得。进一步的，所述的血液透析液为异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌缺血模型大鼠给药生脉注射液后，通过微透析采样得到的血液透析液。进一步的，所述的模型大鼠的造模方法包括以下步骤：实验第一天，雄性SD大鼠大鼠皮下注射ISO生理盐水溶液50mg/kg造模，造模后约12h，进行手术埋植微透析探针。手术前，大鼠腹腔注射5％水合氯醛生理盐水溶液(0.25g/kg体重)，保持在整个手术过程大鼠处于麻醉状态。手术过程采用体温维持仪控制大鼠体温为37℃。施行静脉分离手术，暴露右侧外颈静脉，在外颈静脉与腋静脉交叉处上游约10mm处用手术剪在血管上表面剪出一小口，迅速将事先浸润肝素钠溶液的同轴型探针向心房方向插入血管中，用丝线将探针与血管固定在一起，防止探针滑脱(见图1)。在大鼠颈背部开一小口，将探针的进出口端导管在穿刺针引导下沿皮下从颈背部引出，再用医用手术缝合针线缝合各伤口，并擦上医用碘酒消毒。最后将大鼠置于清醒装置中，并联接上微透析系统各导管，开通微量注射泵以2μL/min流速灌流生理盐水溶液。恢复约12h后，大鼠可自由活动，在实验第二天再次皮下注射ISO生理盐水溶液50mg/kg造模。进一步的，造模后0.5h，在不间断灌流下按10.8mL/kg剂量尾静脉给药生脉注射液。进一步的，所述的血液透析液于给药生脉注射液后5min(去除出液管中的死体积)开始按每15min一份收集透析液，每份30μL，收集至12h止。进一步的，绘制模型大鼠给药生脉注射液后活性成分血药浓度-时间曲线图和药效-时间曲线图；根据血药浓度-时间关系和药效-时间关系建立药动学-药效学结合模型。进一步的，所述的血液透析液通过CMA微透析仪和MAB7同轴型微透析探针收集。进一步的，所述的分析血液透析液中的活性成分的血药浓度时，采用Agilent1200液相色谱仪，和API4000三重四级杆质谱联用仪。具体方法包括：精密量取透析液15μL于微量衬管中，加入15μL地高辛内标溶液(浓度为500ng/mL的地高辛甲醇溶液)，涡旋混合10sec后直接进样分析。色谱条件：色谱柱WatersXbridgeC18柱(2.1mm×50mm，3.5μm)，流动相：0.05％醋酸水溶液(A相)-0.05％醋酸乙腈(B相)，线性洗脱梯度：0min20％B，6min30％B，10min50％B，14min62％B，15min20％B，21min20％B。流速0.5mL·min-1，柱温40℃，进样量20μL。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，多重反应离子监测(MRM)模式，采样间隔200.0msec，碰撞气(CAD)：10psi，气帘气(CUR)：10psi，雾化气(GS1)：40psi，辅助气(GS2)：50psi，离子源温度(TEM)：650℃，正离子模式离子源电压：4500V。进一步的，所述的质谱参数中，人参皂苷Rg1、Rg2、Re、Rf、Rb1、Rd、Rc和内标(IS)的参数去簇电压(DP)分别为120、140、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，包括以下步骤：采用高效液相色谱‑三重四级杆质谱方法分析血液透析液中的活性成分血药浓度，并采用高效液相色谱‑荧光检测技术测定血液透析液中药效指标NO；所述的血液透析液为通过微透析采样得到的血液透析液；所述的活性成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rc；所述的药效指标NO通过测定透析液中NO2－和NO3－总含量获得。

【技术特征摘要】
1.一种给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，包括以下步骤：采用高效液相色谱-三重四级杆质谱方法分析血液透析液中的活性成分血药浓度，并采用高效液相色谱-荧光检测技术测定血液透析液中药效指标NO；所述的血液透析液为通过微透析采样得到的血液透析液；所述的活性成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rc；所述的药效指标NO通过测定透析液中NO2－和NO3－总含量获得。2.根据权利要求1所述的给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，所述的血液透析液为异丙肾上腺素诱导的心肌缺血模型大鼠给药生脉注射液后的血液透析液。3.根据权利要求1所述的给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，所述的血液透析液于给药生脉注射液后5min开始按每15min一份收集透析液，每份30μL，收集至12h止。4.根据权利要求3所述的给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，在检测得到所述的活性成分血药浓度和药效指标NO后，绘制给药生脉注射液后活性成分血药浓度-时间曲线图和药效-时间曲线图；根据血药浓度-时间关系和药效-时间关系建立药动学-药效学结合模型。5.根据权利要求1所述的给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，所述的血液透析液通过CMA微透析仪和MAB7同轴型微透析探针收集。6.根据权利要求1所述的给药生脉注射液后的血液透析液检测方法，其特征在于，所述的分析血液透析液中活性成分的血药浓度时，采用Agilent1200液相色谱仪，和API4000三重四级杆质谱联用仪；具体方法包括：精密量取透析液15μL于微量衬管中，加入15μL浓度为500ng/mL的地高辛甲醇内标溶液，涡旋混合10sec后直接进样分析。7.根据权利要求6所述的给药生脉注射液后的血液微透析液检测方法，其特征在于，色谱条件：色谱柱WatersXbridgeC18柱(2.1mm×50mm，3.5μm)，流动相：0.05％醋酸水溶液(A相)-0.05％醋酸乙腈(B相)，线性洗脱梯度：0min20％B，6min30％B，10min50％B，14min62％B，15min20％B，21min20％B；流速0.5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹淑玉，邵青，丁宝月，阮钰尔，黄嬛，黄雄，刘国强，吕晓庆，姜宁华，
申请(专利权)人：嘉兴学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33