一种羚羊角粉的定量检测方法技术

本发明专利技术涉及化学分析定量检测技术领域，特别涉及一种羚羊角粉中羚羊角的定量检测方法：待检样品经过胰蛋白酶酶解预处理，离心取含有羚羊角肽的上清液；将上清液注入液相色谱‑质谱仪，选择定量离子对；根据线性关系计算羚羊角肽进样浓度，进而计算待检样品中羚羊角的含量。采用酶解并结合UPLC‑MS法，对羚羊角中特征肽进行了含量方法学研究，建立了羚羊角肽的专属性含量测定方法，填补了羚羊角粉的质量标准的空白，提高了羚羊角粉的质量控制水平；）该羚羊角中特征肽含量测定方法的建立，可以大大提高羚羊角粉的质量控制水平，确保羚羊角粉临床用药的有效性。

【技术实现步骤摘要】
一种羚羊角粉的定量检测方法
本专利技术涉及化学分析定量检测
，特别涉及一种羚羊角粉的定量检测方法。
技术介绍
完整的羚羊角包括角壳和骨塞两部分，中医古方所使用的羚羊角均为羚羊角角壳，骨塞不能入药，加工成羚羊角粉时均需要除去骨塞，说明羚羊角角壳应为羚羊角的主要药效部位，故必须控制羚羊角粉中角壳的含量。为扩大药源及保护野生动物，从1995年版《中国药典》开始，规定羚羊角无需除去骨塞连同角壳一并入药，但没有严格控制羚羊角粉中角壳的含量。羚羊角肽（LYJT）来自羚羊角角壳部位，如果企业为降低生产成本大量使用廉价的骨塞代替角壳投料生产，就会导致羚羊角粉中羚羊角肽（LYJT）含量异常。如果不对羚羊角粉中角壳的含量进行质量控制，则无法避免过度使用骨塞代替角壳生产羚羊角粉现象的产生，劣质羚羊角粉会严重影响其功效发挥，导致疗效降低，甚至无效。故非常有必要建立羚羊角粉中羚羊角肽（LYJT）的含量测定法。CN106749599A公开了一种检测黄牛角、水牛角、山羊角和绵羊角中共有的角蛋白特征肽来确定羚羊角中是否掺假的方法。但其中只是提供了黄牛角、水牛角、山羊角和绵羊角中共有的角蛋白特征肽的检测离子对，没有记载羚羊角蛋白特征肽的检测离子对。
技术实现思路
2015年版《中国药典》中规定羚羊角为牛科动物赛加羚羊SaigatataricaLinnaeus的角，猎取后锯取其角，晒干。羚羊角粉由羚羊角粉碎而成的细粉。现行的羚羊角粉标准中无主要成分角蛋白的含量控制指标，无法对本品质量进行评价，无法保证临床用药的疗效。为了解决以上现有技术中没有对羚羊角中主要成分角蛋白的定量检测方法的问题，本申请提供了一种羚羊角粉的含量检测方法。本专利技术是通过以下步骤得到的：一种羚羊角粉的含量检测方法，包括以下步骤：（1）待检样品经过胰蛋白酶酶解预处理，离心取可能含有羚羊角肽的上清液；（2）将上清液注入液相色谱-质谱仪，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，选择m/z（三电荷）697.66→1021.48、697.66→1181.49作为羚羊角肽的检测离子对，m/z（三电荷）697.66→1021.48为定量离子对；（3）提取离子697.66→1021.48色谱图，在保留时间5.24±0.2min处的色谱峰，在羚羊角肽进样浓度0.02528～2.528μg/ml范围内，以峰面积值为y，进样浓度为x，根据回归方程y=15309x+91.47，r=0.9996，计算羚羊角肽进样浓度，进而计算待检样品中羚羊角肽的含量。专属性的离子对来自专属性多肽的质谱响应信号，所以必须从成百上千种蛋白中找出羚羊角区别其它角的差异性氨基酸序列，而且该差异性序列必须稳定存在于不同批次的羚羊角中，通过优选角蛋白酶切酶，将获得的全部肽段通过超高分辨质谱仪检测，将获得的数据通过数据库比对，分析出不同角样品所含有的主要角蛋白及氨基酸序列，然后从复杂的蛋白中找出差异性的氨基酸序列及对应的多肽，并进一步判断序列是否会稳定出现，再根据软件预测出该特征性肽段的检测离子对，并将该离子对在低分辨率质谱仪上对多批次样品进行验证，从而进一步对专属性的离子对进行确认，所以，特定物质的离子对的选择，是一项非常有难度的工作,并且还要进一步定量检测，难度就更大了。所述的方法，优选羚羊角肽检出限2.528ng/ml，定量限为12.64ng/ml。所述的方法，优选胰蛋白酶酶解预处理操作如下：待检样品经变性缓冲液和二硫苏糖醇溶液处理后，放冷至室温，离心，上清液加入碘代乙酰胺溶液，避光反应，混匀，离心，上清液加入碳酸氢铵溶液和牛胰蛋白酶溶液，酶解，置90℃处理，取出放冷至室温，离心得上清液。羚羊角的主要活性成分为角蛋白，而角蛋白不溶于水和有机溶剂。主要是因为角蛋白中含有丰富的胱氨酸,形成了大量二硫键,且角蛋白分子主链间能形成氢键和离子键等空间联键，从而赋予了角蛋白紧密的结构,使其难溶于一般溶剂。为进行角蛋白的研究，需要破坏氢键，打开二硫键及其他化学键，同时不能破坏蛋白质的肽键。本实验采用高浓度(6mol/L)的盐酸胍破坏羚羊角角蛋白分子间的氢键，用二硫苏糖醇（DTT）将角蛋白分子中的二硫键打开，溶解角蛋白，用碘代乙酰胺（IAA）保护巯基，最后加入胰蛋白酶酶解，获得羚羊角角蛋白特征肽，采用UPLC-MS法对该多肽进行定量研究，从而建立了羚羊角粉专属性的含量测定方法。所述的方法，优选液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：液相条件：色谱柱为ACQUITYUPLC®BEHC18，2.1×50mm，1.7μm，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序：0-3min，流动相A95%，流动相B5%；3-8min，流动相A95%→50%，流动相B5%→50%；8-8.1min,流动相A50%→10%，流动相B50%→90%；8.1-10min,流动相A10%，流动相B90%，10-10.1min,流动相A10%→95%，流动相B90%→5%，10.1-12min,流动相A95%，流动相B5%；质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，鞘气流速，46L/hr；辅助气流速，850L/hr；喷雾电压，3.5Kv；离子源温度,150℃；辅助气温度，400℃。所述的方法，优选胰蛋白酶酶解预处理操作如下：将待检样品10mg加入10mL变性缓冲液和1mL二硫苏糖醇溶液，摇匀，置90℃处理4h，取出放冷至室温，离心，取上清液500μL，加入100μL碘代乙酰胺溶液，避光反应30min，混匀，离心，取上清液100μL，加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，离心得上清液。所述的方法，优选离心操作为12000rpm离心10min；牛胰蛋白酶溶液浓度为10mg/mL。所述的方法，优选进样体积为5µl。所述的方法，优选所述为电喷雾电离(ESI),正离子模式。所述的方法，优选变性缓冲液制备如下：称取573.1g盐酸胍，121.1g三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得。所述的方法，优选所述待检样品为羚羊角粉、羚羊角胶囊。本专利技术的有益效果：1）经大量实验研究及蛋白质数据库比对，寻找到了羚羊角区别于常见伪品山羊角、水牛角和黄牛角的专属性的羚羊角肽（LYJT），采用酶解并结合UPLC-MS法，对羚羊角粉中特征肽进行了含量方法学研究，建立了羚羊角肽的专属性含量测定方法，填补了羚羊角粉的质量标准的空白，提高了羚羊角粉的质量控制水平；2）该羚羊角粉中特征肽含量测定方法的建立，可以大大提高羚羊角粉的质量控制水平，确保羚羊角粉临床用药的有效性。附图说明图1专属性考察-空白溶液图谱，图2专属性考察-LYJT对照品图谱，图3专属性考察-样品SFX-60图谱，图4进样量与色谱峰面积线性关系图，图5检出限图谱（离子对：697.66→1021.48），图6定量限图谱（离子对：697.66→1021.48）。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明：下述实施例中相关溶液的制备方法如下：变性缓冲液：称取573.1g盐酸胍，121.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羚羊角粉的含量检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）待检样品经过胰蛋白酶酶解预处理，离心取可能含有羚羊角肽的上清液；（2）将上清液注入液相色谱‑质谱仪，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，选择m/z（三电荷） 697.66→1021.48、697.66→1181.49作为羚羊角肽的检测离子对，m/z（三电荷） 697.66→1021.48为定量离子对；（3）提取离子697.66→1021.48色谱图，保留时间5.24±0.2min处的色谱峰，在羚羊角肽进样浓度0.02528～2.528μg/ml范围内，以峰面积值为y，进样浓度为x，根据回归方程y = 15309x + 91.47，r = 0.9996，计算羚羊角肽进样浓度，进而计算待检样品中羚羊角肽的含量。

【技术特征摘要】
1.一种羚羊角粉的含量检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）待检样品经过胰蛋白酶酶解预处理，离心取可能含有羚羊角肽的上清液；（2）将上清液注入液相色谱-质谱仪，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，选择m/z（三电荷）697.66→1021.48、697.66→1181.49作为羚羊角肽的检测离子对，m/z（三电荷）697.66→1021.48为定量离子对；（3）提取离子697.66→1021.48色谱图，保留时间5.24±0.2min处的色谱峰，在羚羊角肽进样浓度0.02528～2.528μg/ml范围内，以峰面积值为y，进样浓度为x，根据回归方程y=15309x+91.47，r=0.9996，计算羚羊角肽进样浓度，进而计算待检样品中羚羊角肽的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于羚羊角肽检出限2.528ng/ml，定量限为12.64ng/ml。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于胰蛋白酶酶解预处理操作如下：待检样品经变性缓冲液和二硫苏糖醇溶液处理后，放冷至室温，离心，上清液加入碘代乙酰胺溶液，避光反应，混匀，离心，上清液加入碳酸氢铵溶液和牛胰蛋白酶溶液，酶解，置90℃处理，取出放冷至室温，离心得上清液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：液相条件：色谱柱为ACQUITYUPLC®BEHC18，2.1×50mm，1.7μm，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序：0-3min，流动相A95%，流动相B5%；3-8min，流动相A95%→50%，流动相B5%→50...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉团，杭宝建，咸瑞卿，梁翠荣，巩丽萍，石峰，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37