本发明专利技术公开了一种CART细胞体内表达效率的检测方法，包括如下步骤：将表达CD19CAR的质粒加入未转染PBMC中提取基因组作为标准品一、将已知表达效率的CART细胞加入未转染PBMC中提取基因组作为标准品二、将梯度稀释PBMC细胞基因组，测内参CDKN1A作为标准品三，三种标准品联合应用做标准曲线，待呈线性关系后，运用荧光定量PCR技术检测CART细胞整合到全基因组DNA中的病毒拷贝数和CART细胞的占PBMC中的百分含量。本发明专利技术可计算CART细胞的体内表达情况，计算方法简便，且精确度高，便于实际操作。
A technique for detecting CART cell expression in vivo and its application
The present invention discloses a method for detecting expression efficiency in CART cells, including the following steps: adding CD19CAR plasmid to untransfected PBMC and extracting genome as standard product, adding CART cells with known expression efficiency into untransfected PBMC to extract genome as standard two, gradient dilution PBMC cell gene Group CDKN1A was used as standard product three and three standard products to do standard curves. After linear relationship, fluorescence quantitative PCR was used to detect the number of viral copies of CART cells integrated into the whole genome DNA and the percentage of CART cells in PBMC. The invention can calculate the expression of CART cells in vivo, and the calculation method is simple and accurate, and is convenient for practical operation.
【技术实现步骤摘要】
一种体内检测CART细胞表达的技术及其用途
本专利技术属于嵌合抗原受体领域，具体用荧光定量PCR和流式细胞仪方法检测体内CART细胞表达。
技术介绍
嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CART)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CART细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CART细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CART的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。随着嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CART)技术的不断发展，目前CART主要可划分为四代。第一代CART细胞由胞外结合区-单链抗体(singlechainfragmentvariable，scFV)、跨膜区(transmembraneregion，TM)和胞内信号区-免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosinebasedactivationmotif，ITAM)组成，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3ζ。第一代CAR虽然能够看到一些特异性的细胞毒性，但2006年对其进行临床试验总结的时候却发现疗效差强人意。究其原因是因为第一代CART细胞在病人体内很快就会耗竭，其持久性很差，以至于CART细胞还没有来得及接触到大量的肿瘤细胞时就已经凋亡了该种CART细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，但其在体内的存活期较短不能激发持久的抗肿瘤效应〔，CancerRes.2007，67(22)：11029-11036〕。第二代CART细胞优化CAR设计中T细胞活化信号区仍然是研究的热点。T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号。早在1998年就出现了第二代CAR(JImmunol.1998；161(6)：2791-7)。第2代CAR在胞内信号肽区添加了一个协同刺激分子，即把协同刺激信号组装到CAR里面，能够更好的为CART细胞提供活化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化，能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以及增强T细胞抵抗凋亡的能力。随后又出现了CD134(OX40)和41BB(4-1BB)等共刺激分子，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等。这样的第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的ALL病人，其完全缓解率高达90％以上。第三代CAR信号肽区整合2个以上的协同刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力更加显著，即新一代的CAR可获得更强的抗肿瘤应答(MolTher.2005，12(5)：933-941)。最典型的就是UPenCarlJune在CD28刺激因子的作用下又加了一个41BB的刺激因子。第四代的CART细胞则加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可以产生IL-12，其能够调节免疫微环境-增加T细胞的激活，同时激活固有免疫细胞使其发挥作用来清除靶抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用〔ExpertOpinBiolTher.2015；15(8)：1145-54〕。当CART细胞输注体内之后，CAR基因能否表达、CAR表达效率的高低、CART细胞的活性和纯度以及CART细胞在体内存活的长短都会直接影响CART细胞对癌细胞的清除效率。临床研究证明，CART细胞回输后在患者外周血中的增殖能力和其在外周血存续的时间与疗效具有很强的相关性(ScienceTranslationalMedicine.2015；7:303)。目前，主流的临床试验采用单一的实时荧光定量PCR的方法检测外周血基因组中的CAR含量，进而间接估算CART细胞数量。但是，CAR在基因组中的拷贝数与载体特征、病毒滴度、细胞状态等都有关系，会进一步导致通过检测外周血基因组中的CAR含量估算CART细胞的误差。因此，准确、快速的检测CAR含量对于该疗法的实施、监测以及预后具有关键意义。本专利技术的亮点是既利用表达CAR的质粒做标准品1、同时也利用流式检测出的已知表达量的CART细胞做为标准品2、同时也引入了内参标准品3；3种标准品的同时引入，增加了测量的准确度。只有在CAR的质粒做标准品与CART细胞做为标准品做梯度稀释后呈现线性关系，才可用此标准曲线。我们根据血液中用real-timePCR检测CAR的拷贝数来计算CART细胞此时在PBMC中的百分含量，以此来推断CART细胞输注后在各个时间点的表达量和在体内存续的时间。
技术实现思路
本专利技术采用的技术方案是：运用real-timePCR方法和流式两种实验方法联合检测体内CART细胞的表达情况，本专利技术运用了三种标准品，提高了检测的准确性。本专利技术所述CD19-scFv氨基酸序列如序列表中SEQUNCEIDNO.1所示。本专利技术所述CD19-scFv核酸序列如序列表中SEQUNCEIDNO.2所示。本专利技术所述嵌合抗原受体以人的CD8α铰链区、人的CD28α跨膜区、人的CD28胞内的共刺激元件和人的CD3ζ胞内区串联成的结构为信号转导结构域，其氨基酸序列如SEQUNCEIDNO.3所示。本专利技术所述嵌合抗原受体以人的CD8α铰链区、人的CD28α跨膜区、人的CD28胞内的共刺激元件和人的CD3ζ胞内区串联成的结构为信号转导结构域，其核酸序列如SEQUNCEIDNO.4所示。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用CD19scFv基因序列，并从NCBIGenBank数据库中搜索到人的CD8α铰链区、人的CD28跨膜区、人的CD28胞内区和人的CD3ζ胞内区基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受体CD19scFv-CD8H&CD28TM-CD28-CD3ζ的基因片段即编码CAR的核酸序列。本专利技术的亮点是既利用表达CAR的质粒做标准品1、同时也利用流式检测出的已知表达量的CART细胞做为标准品2、同时也引进了内参标准品3；3种标准品的同时引入，增加了测量的准确度。只有在CAR质粒做本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测CART转导效率的引物，其特征在于：包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为：GGGTTCCAAGCCGATTCAGT，即SEQ ID NO：5；所述下游引物的序列为：CAAGTTGCTAATGGTCAGGGAATA，即SEQ ID NO：6。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测CART转导效率的引物，其特征在于：包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为：GGGTTCCAAGCCGATTCAGT，即SEQIDNO：5；所述下游引物的序列为：CAAGTTGCTAATGGTCAGGGAATA，即SEQIDNO：6。2.一种与权利要求1所述的引物配合内参序列，其特征在于：包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为：GAAAGCTGACTGCCCCTATTTG，即SEQIDNO：7；所述下游引物的序列为：GAGAGGAAGTGCTGGGAACAAT，即SEQIDNO：8。3.一种用于外周血中检测CART表达效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)DNA模板的制作：无菌环境中，取培养后的CART细胞，提取DNA；2)系列标准品的制作：使用CAR的质粒作为...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄飞，金涛，王海鹰，何凤，史子啸，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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