一种优质高产三七的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光定量PCR实验鉴定优质高产三七的方法，包括以下步骤：(1)待测三七根样品总RNA提取；(2)三七根样品的miRNAcDNA第一链合成；(3)三七根样品的RNAcDNA第一链合成；(4)以RNA和miRNA的cDNA第一链为模板，用特异性引物和试剂盒，进行荧光定量PCR检测，根据实时荧光定量PCR检测结果，采用相对定量解析方法，即2‑△△Ct进行判断，即：(1)miR156g‑5p的实时荧光PCR结果即2‑△△Ct高于6.396；或(2)靶基因SPL 5的实时荧光PCR结果即2‑△△Ct低于0.046，则待检测样品为优质高产三七植株。采用本发明专利技术所提出的方法能对高产三七进行快速鉴定。

An identification method for high yield and high yield 37

The present invention discloses a method for identification of high quality and high yield 37 based on the fluorescence quantitative PCR experiment, including the following steps: (1) the total RNA extraction of 37 samples is to be measured; (2) miRNAcDNA first chain synthesis of 37 samples; (3) RNAcDNA first chain synthesis of 37 samples; (4) the cDNA first chain of RNA and miRNA is a template, and the specificity is specific The primers and kits were detected by fluorescence quantitative PCR. According to the real-time fluorescence quantitative PCR detection results, a relative quantitative analytical method was used to determine the real time fluorescence PCR results of (1) miR156g 5p 5p (2), or (2) the real-time fluorescent PCR result of the target gene SPL 5, that is, 2, Delta Delta Delta Ct below 0. 46, the tested samples were 37 plants with good quality and high yield. The method of the invention can be used for fast identification of high yield 37.

【技术实现步骤摘要】
一种优质高产三七的鉴定方法
本专利技术涉及生物化学与分子生物学检测
，具体涉及优质高产三七的鉴定方法。
技术介绍
三七为五加科(Araliaceae)人参属三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)的干燥根，明代著名的药学家李时珍称其为“金不换”。三七含有皂苷、糖类、氨基酸等多种活性成分，具有止血、消肿定痛等功效。现代药理学研究证明，三七具有止血、抑制血栓形成的功效，还可以作用于心脑血管系统，保护心肌，抗冠心病；作用于中枢神经系统可以镇静、镇痛、增智；同时兼具抗炎、降血脂的功能；最近研究发现三七还有抗癌功能，三七发挥抗肿瘤作用的活性成分主要为三七皂苷和黄酮。三七皂苷可以通过多种方式起到抗肿瘤作用，例如直接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长；转移、诱导肿瘤细胞凋亡；诱导肿瘤细胞分化使其逆转、增强，刺激机体免疫功能等。目前，以三七为配方进入《国家基本药物目录》和《国家中药保护品种目录》的制剂达20余种。三七是我国名贵的特产中药材，药用历史非常悠久，在世界上主要分布于中国、缅甸和尼泊尔，在中国主要分布在云南、四川及广西等地区，云南省又是世界和我国的三七主要产地。据统计，2015年云南省的三七总产量超过三万吨，直接经济产值超过160亿元。这些数字显示出三七对于云南的国民经济和社会发展都具有举足轻重的地位。三七产地的分布在药用植物中属比较特殊的。三七是我国为数不多的对气候环境条件要求十分严格的中药材品种，虽然栽培历史上曾有10余省区引种，但几乎都没有成功。三七主要生长在冬暖夏凉、无严寒与酷暑、潮湿的特定环境中，即低纬度、高海拔地区中，适应能力低，因此限定了三七只适合生长在云南文山州及广西靖西等很小的地理范围内，同时，三七常年生长在荫蔽环境中，在这样的环境条件下，各种病害的频发，已发现的病虫害种类达20多种，如三七黑斑病等，每年都给三七生产造成严重损失。目前三七优质高产的措施大多在栽培技术、施肥管理等种植层面，而在如何选种播种层面并没有类似报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种采用实时荧光PCR实验鉴定优质高产三七的方法，有利于解决在三七种植及生产过程中缺乏优良品种的问题。本专利技术采用以下技术方案实现：一种优质高产三七的鉴定方法，包括如下步骤：步骤一，待检测三七根样品总RNA提取；用Trizol法提取三七根总RNA。步骤二，三七根样品的miRNAcDNA第一链合成；将待检测样品总RNA中的miRNA(长度小于50核苷酸)反转录成cDNA，并合成第一链，用于miRNA实时荧光PCR分析。步骤三，三七根样品的RNAcDNA第一链合成；将待检测样品RNA反转录成cDNA第一链，用于靶基因实时荧光PCR分析。步骤四，以RNAcDNA第一链和miRNAcDNA第一链为模板，用特异性引物和试剂盒，进行荧光定量PCR检测：对RNAcDNA第一链采用RT-qPCR反应条件为：a、95℃2min，1个循环，起始模板变性；b、95℃15s，60℃1min，40个循环，PCR扩增。对miRNAcDNA第一链采用RT-qPCR反应条件为：a、94℃2min，1个循环，起始模板变性；b、94℃20s，35-45个循环，PCR循环中模板变性；c、60℃34s，35-45个循环，退火，延伸。步骤五，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果。采用相对定量解析方法即2-△△Ct法(△△Ct＝(Ct目标基因-Ct内参基因)-(Ct对照基因-Ct内参基因))计算目标基因在样品中的相对表达水平。如果待检测样品实时荧光PCR的结果(采用相对定量解析方法计算)为：(1)miR156g-5p的实时荧光PCR结果即：2-△△Ct高于6.396；或(2)靶基因SPL5的实时荧光PCR结果即：2-△△Ct低于0.046，则待检测样品为优质高产三七植株。步骤四中，(1)扩增miR156g-5p特异性引物序列如下：正向引物SEQIDNO.5：5'GCGCTTGACAGAAGATAGAGAGCAC3'；反向引物由试剂盒提供；对照组为5.8Sribosomal(核糖体)RNA：正向引物SEQIDNO.6：5'CGATGAAGAACGTAGCGAAATGC3'；(2)扩增靶基因SPL5(SQUAMOSApromoter-bindingprotein-like5)特异性引物序列如下：正向引物SEQIDNO.3：5'AACACTTGGCTCTTTGATTGG3'反向引物SEQIDNO.4：5'CCTCCTAGTTTCCTTGCTTACC3'；对照组PanaxnotoginsengactinPnACT2为三七的内参基因正向引物SEQIDNO.1：5'TCCAAGGGTGAATATGATGAATCG3'反向引物SEQIDNO.2：5'AACCTCTCCAAAGAGAATTTCTGAGT3'；步骤四中，对待检测样品成分进行实时荧光PCR扩增时，应设立两个对照：5.8Sribosomal(核糖体)RNA为miR156g-5p的对照组，PanaxnotoginsengactinPnACT2为靶基因SPL5的对照组。原理：miR156g-5p的相对表达量与根重呈正相关关系，SPL5(SQUAMOSApromoter-bindingprotein-like5)与根重呈负相关关系，miR156g-5p可以通过抑制靶基因SPL5来促进根的生长。(miR156g-5p及其靶基因SPL5与根重的相关关系：根据总根重进行分组，把三七样本分成大中小三组，分组依据为μ±0.5σ，根重小于μ-0.5σ的作为小组，大于μ+0.5σ作为大组，介于μ-0.5σ与μ+0.5σ之间的作为中组。16个样本按根重从小到大编号1-16，1-8号为small组，9-12号为media组，13-16号为large组，样本与根重的关系如图1所示。miR156g-5p及SPL5的相对表达量在不同根重组中的比较如图2所示，从图中可以看出，miR156g-5p的相对表达量相对于根重有较明显的趋势，随着根重的增加，miR156g-5p的相对表达量也增加，并且在小组中miR156g-5p的相对表达量很小，均小于SPL5，而在大组中，miR156g-5p的相对表达量非常高，是SPL5的5-9倍；然而SPL5的相对表达量在小组中较高，在中组和大组中均很低，随着根重的增加而降低。由此可以初步得出结论：miR156g-5p的相对表达量与根重呈正相关关系，SPL5与根重呈负相关关系。图3为进一步验证miR156g-5p的相对表达量与三七根重的相关性，经计算，miR156g-5p的相对表达量与根重之间的相关性系数(CorrelationCoefficient，CC)为0.81，P值为1.0×10-4，可以看出miR156g-5p与根重呈显著正相关(P<0.05)。图4为SPL5的相对表达量与根重之间的相关性分析，经计算，SPL5的相对表达量与根重之间的相关性系数为-0.63，P值为8.4×10-3，SPL5的相对表达量与根重呈显著负相关。图5为miR156g-5p的相对表达量在小根重组与大根重组中的差别，可以看出miR156g-5p在小根重组与大根重组中的表达量差异极显著，进一步确认miR15本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种优质高产三七的鉴定方法，包括如下步骤：(1)待检测三七根样品总RNA提取；(2)将待检测样品总RNA中的miRNA反转录成cDNA，并合成第一链，用于miRNA实时荧光PCR分析；(3)将待检测样品RNA反转录成cDNA第一链，用于靶基因实时荧光PCR分析；(4)以RNA cDNA第一链和miRNA cDNA第一链为模板，用特异性引物和试剂盒进行荧光定量PCR检测；以PnACT2为三七的内参基因，是SPL5的对照组；以5.8S ribosomal RNA为miR156g‑5p的对照组；(5)根据实时荧光定量PCR检测结果进行判断；其特征在于，步骤(2)中所述miRNA为miR156g‑5p，步骤(3)中所述RNA为SPL5，步骤(4)中所述特异性引物如下表所示：

【技术特征摘要】
1.一种优质高产三七的鉴定方法，包括如下步骤：(1)待检测三七根样品总RNA提取；(2)将待检测样品总RNA中的miRNA反转录成cDNA，并合成第一链，用于miRNA实时荧光PCR分析；(3)将待检测样品RNA反转录成cDNA第一链，用于靶基因实时荧光PCR分析；(4)以RNAcDNA第一链和miRNAcDNA第一链为模板，用特异性引物和试剂盒进行荧光定量PCR检测；以PnACT2为三七的内参基因，是SPL5的对照组；以5.8SribosomalRNA为miR156g-5p的对照组；(5)根据实时荧光定量PCR检测结果进行判断；其特征在于，步骤(2)中所述miRNA为miR156g-5p，步骤(3)中所述RNA为SPL5，步骤(4)中所述特异性引物如下表所示：。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(4)中，对miRNAcDNA第一链的RT-qPCR反应条...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑云，李世鹏，廖沛然，崔秀明，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53